Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

שלום, שמי אלן ואני מהמעבדה של ד"ר Horney Lu באוניברסיטת קליפורניה אירביין, במחלקה לנוירוביולוגיה והתנהגות. ואני בוב. היום, ד"ר Haro יציג בפניכם פרוטוקול מהיר, יעיל ואמין להקפאה שגרתית (cryo preservation) של בלוקים מרקמת קליפת המוח, לצורך יצירת תרביות ראשוניות של נוירונים באיכות גבוהה.

אם כך, נתחיל. רקמה נקייה וחתוכה מוכנסת למבחנות הקפאה (cryo vials) המכילות תוך כדי תהליך Medium הקפאה 10%TMSO.

מבחנות קריו נטענות לתוך מכל הקפאה ומונחות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות. לאחר מכן, מבחנות הקריו הקפואות מועברות לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. לצורך תרבית, מבחנת קריו של AC מופשרת באמבט מים חמים ונשטפת ב-HBSS חם כדי להסיר את ה-DMSO שנותר.

מוסיפים HBSS טרי יחד עם trypsins לצורך דיסוציאציה, ולאחר מכן מוסיפים DMM עם 10% EBS. כדי להפסיק את הפעילות האנזימטית של הדיסוציאציה, מרכזים את התאים באמצעות ספינטדאון ואת המשקע מרסספנדים ב-DMM טרי בתוספת 10% EBS וזורעים בצלחות מצופות polylysine. לאחר 24 שעות, מחליפים את ה-DMM במצע neuro basal מועשר, ומגדלים את התאים למשך 10 ימים.

פרוטוקול זה משתמש בלהב תער מפלדה לקיצוץ של רקמת קורטקס לפני השימוש. יש לעקר את התער ב-70% ethanol למשך שעתיים לפחות. תמיסת מלח רב-ערכית של Hank's בריכוז 1x HBSS מוכנה על ידי דילול של תמיסת מלאי בריכוז 10x במים סטריליים; לאחר מכן, את ה-1x HBSS שומרים על קרח או בטמפרטורה של 4°C עד לעיבוד הרקמה.

דימתיל סולפוקסיד או DMSO משמש כחומר קריו-פרוטקטיבי (מגן קור) בתמיסת ההקפאה. פרוטוקול זה משתמש בדילול של 10% (נפח לנפח) של DMSO ב-1X-H-B-S-S-D-M-S-O, אשר יש לערבב באופן מלא לפני אחסון בטמפרטורה של 4 °C. מיכל הקפאה של Nalgene משמש לשליטה על קצב ההקפאה של הדגימות.

מכלי ההקפאה נטענים במבחנות קריו בנפח 2.5 מיליליטר שסומנו מראש. מומלץ גם לסמן את מכלי ההקפאה עצמם אם ישנם יותר ממכלי אחד, ולציין את המכל התואם על המבחנה. ה-10% DMSO שקולל מראש, מדיום ההקפאה ומכלי ההקפאה מועברים אל תוך קבינה בטוחה ביולוגית סטרילית.

כאן מוסיפים לאט מיליליטר אחד של תמיסת הקפאה לכל אחד ממבחנות הקריו. לאחר שווידאנו כי הפקקים סגורים היטב, מניחים את מכל ההקפאה עם המבחנות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius למשך שעתיים לפחות רגע לפני עיבוד הרקמה. יש לשטוף ביסודיות את להב התערה שעבר עיקור קודם לכן: שלושה שטיפות, כל אחת למשך שלוש דקות.

שימוש במים סטריליים אמור להספיק להסרה של שאריות אתנול. הליך שטיפה זה צריך להיות מהיר, שכן התער אמור להתרחשן מעל טבילה ממושכת ובמים סטריליים. לפני הניקוי, יש להניח את הרקמה על מאre קרח.

שטפו קלות עם cold one X-H-B-S-S כדי להסיר שאריות צפות. השתמשו במחטים סטריליות כדי לנקות מחתיכות הרקמה ממברים וכלי דם שנותרו. יש לנקוט משנה זהירות כדי לשמור על השלמות המבנית של הרקמה במהלך הניקוי.

ככל שפעולה זו תגבר, יעילות הקיצוץ של רקמה נקייה תהיה שונה באופן ניכר מזו של רקמה גולמית, ומרבית הממברנות או כלי הדם צריכים להיות מוסרים. ברגע שהרקמה ננקתה ונשטפה, ניתן להתחיל בקיצוץ. חשוב לבצע חיתוכים נקיים של הרקמה ליצירת קוביות בגודל של כ-1 mm³.

בלוקים גדולים מדי גורמים לירידה בתשוא התאים בעת ההפשרה. עם זאת, בבלוקים קטנים יותר, יש להימנע מעיבוד יתר. ניתן לאסוף רקמה קצוצה באמצעות פיפט אוטומטית ומעט cool one X-H-B-S-S.

יש להקפיד לשטוף את הצלחת בעזרת HBSS כדי להחזיר את כל הרקמה שנאספה. לאחר מכן, מוסיפים את הרקמה לנפח גדול של one X-H-B-S-S ומניחים לה לשקוע לתחתית, כך שייווצר pellet דחוס באופן רופף. פעולה זו מנקה שאריות פסולת שעלולות להיות נוכחות. בעוד הרקמה שוקעת ב-HBSS, יש להוציא את מכל ההקפאה והמבחנות לקריו (cryo vials) שהוקפאו מראש, לפני חלוקת הרקמה.

יש לוודא כי כל המבחנות פתוחות כדי להאיץ את תהליך מילוי הרקמה. יש להגביל את החשיפה ל-DMSO בטמפרטורת החדר ל-10 דקות לכל היותר. מומלץ לעבוד עם מיכל הקפאה אחד בכל פעם עד לניצול כל הרקמה.

התחל לשאוב את הנוזל העליון של רקמה רפויה, גרגרת תירס, קרוב ככל האפשר למשקע מבלי להפריע לו. לאחר מכן, התאם טיפ עם פתח רחב של 200 microliter לפיפט. אין להשתמש בטיפ עם פתח קטן יותר, שכן הדבר יפגע במבנה הבלוקים היורדים לתחתית משקע בלוק הרקמה.

אספו 200 microliters של רקמה באיטיות. העבירו רקמה זו למבחנה לקריו (cryo vial) והמשיכו למבחנה הבאה עד שכל המבחנות יתמלאו. ייתכן שיהיה צורך בהפעלת כלל 10 הדקות.

העבירו במהירות את מיכל ההקפאה עם מבחנות הקריו (cryo vials) למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות לפחות, או למשך הלילה אם הזמן מוגבל. לאחר זמן מספיק, הוציאו את מיכל ההקפאה מהמקפיא והעבירו את מבחנות הקריו לקופסת קריו במהירות המרבית. הניחו את קופסת הקריו במדף של מיכל חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.

הוצאו מבחנה לקריו (cryo vial) מחנקן נוזלי במהירות רבה ככל האפשר, תוך הגבלה של חשיפת קופסאות הקריו לטמפרטורת החדר. הפשירה את הדגימה במהירות על ידי טבילה בבן-מטב של 37 °C. הקפידו תמיד להשאיר את הפקק מעל פני המים. בדקו בתדירות גבוהה והמשיכו בהפשרה עד שיתבחן גביש קרח קטן.

לפני הכנסת המבחנה לתא המבטיח, סטריליזציה של מבחנת הקריו באמצעות 70% ethanol. המשך בהוספת הרקמה שהופשרה לנפח גדול של 1X HBSS חמים אם נותרה רקמה על דפנות מבחנת הקריו. אסוף בעדינות באמצעות HBSS.

לאחר איסוף כל הרקמה, הפוך את המבחנה שלוש עד ארבע פעמים והמתן עד שהרקמה תשקע לתחתית. שלב זה מבטיח דילול מספיק של DMSO.

לאחר שהרקמה שקעה, שאבו כמה שיותר מהנוזל העליון. לאחר מכן, הוסיפו לכך 10 milliliters של HBSS בריכוז 1X טרי וחם. הוסיפו 300 microliters של 0.25% trypsin ו-50 microliters של DNase.

המשיכו בפירוק הרקמה תוך써 ערעור עדין, עד ליצירת תרחיף תאים עכור לאחר פירוק הרקמה. הפסיקו את הפעילות האנזימטית על ידי הוספת DMEM חמים בתוספת 10% bovine serum. סבבו את תרחיפי התאים ב-1200 G למשך חמש דקות. השעיקו מחדש את משקע התאים ב-DMEM טרי בתוספת 10% EBS והעבירו לצלחות מצופות ב-polylysine.

אפשרו לתאים להיקשר לפיתחים למשך 30 דקות. לאחר מכן, החליפו את המצע במצע DM טרי בתוספת 10% EBS. לאחר 24 שעות, החליפו את המצע המכיל DM במצע neuro basal בתוספת N two ו-B 27, וגדלו למשך 10 ימים.

פירטנו כעת פרוטוקול נרחב, יעיל ואמין לשימור קריוגני שגרתי של גושי רקמה קורטיקלית. בהצלחה.