בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד מיטוכונדריה ולבצע מדידת נשימה מיטוכונדריאלית. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד שריר שלד מחולדות המייובשות בהתזה. לאחר מכן, השריר עובר הומוגניזציה והמיטוכונדריה מבודדות באמצעות סנטריפוגציה.

לאחר מכן, ריכוז החלבון נקבע באמצעות בדיקת ברדפורד (Bradford assay). לבסוף, נשימה מיטוכונדריאלית נמדדת באמצעות פוליגרפיה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות צריכת חמצן דרך מצבי הנשימה המיטוכונדריאליים השונים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מרכזיות בתחום השריר השלדי, כגון השפעת התערבויות שונות על התפקוד המיטוכונדריאלי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מטבוליזם בשריר השלדי, ניתן ליישמה גם על איברים אחרים כגון כבד, מוח, כליה, או כמעט כל רקמה אחרת. לפני תחילת הפרוצדורה, להכנת בידוד של שריר שלדי, הכין את התמיסות הבאות: P-B-S, P-B-S בתוספת 10 millimolar EDTA, באפר בידוד מיטוכונדריה פי 8, באפר בידוד 1 או IB1, באפר בידוד 2 או IB2 ובאפר ניסויי או EB.

ראו את הפרוטוקול הכתוב המצורף להוראות. לאחר מכן, הפעילו את הצנטריפוגה וכוונו אותה ל-4 °C. הפעילו מקבץ מים וכוונו אותו ל-37 °C.

בתוך דלי מתאים, הניחו שלושה כוסות כימיות של 10 milliliter, potter elbow, מטחני רקמה של gem, מספריים כירורגיים קטנים ו-10 מבחנות מיקרו-צנטריפוגה על קרח. יש לשמור על כל הרכיבים קרים מאוד לאורך כל הניסוי. הניחו את IB one ואת IB two על קרח ואת EB בתוך מקבץ מים חמים.

לאחר מכן, הוסיפו את התמיסות הבאות לשלוש כוסות המעבדה שעל הקרח: לכוס אחת 10 milliliters של PBS, לכוס שתיים 10 milliliters של P-B-S-E-D-T-A, ולכוס שלוש 3 milliliters של ib. 1. השמידו חולדה בהתאם לנהלים המאושרים על ידי הוועדה המקומית לטיפול בבעלי חיים ושגרירותם (IACUC).

בשלב הבא, בודדו במהירות 250 עד 500 מיליגרם של שריר שלד באמצעות פינצטה ומספרי Mayo. שטפו את הרקמה בבכור one, ואז העבירו אותה לבכור two, כדי להומוגניзировать את השריר. ראשית, העבירו אותו לבכור three, ולבסוף קצצו אותו בעזרת מספריים.

העבירו את התמיסה להומוגניזטור מסוג potter Elva והומוגניזו את השריר באמצעות עקת מנוע 10 פעמים, תוך שמירה על המבחנה בקרח בכל עת. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 ml שקוללו מראש, וסובבו בצנטריפוגה ב-700 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C. העבירו את הסופרנטנט למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה שקוללה מראש והשליכו את המשקע.

סנטריפוגה את העלייה (supernatant) ב-10,500 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, העבר את ה-SNAT למבחנת מיקרו-סנטריפוגה חדשה ומלאה מראש, וסמן אותה כ-SN1 וסוג השריר. השהה את המשקע (pellet) ב-500 µL של IB2, ולאחר מכן בצע סנטריפוגה ב-10,500 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C. העבר את העלייה למבחנת מיקרו-סנטריפוגה חדשה ומלאה מראש, וסמן אותה כ-SN2 וסוג השריר.

שעלה את משקע המיטוכונדריה הסופי ב-100 microliters של IB two. סובב אותו במיני-צנטריפוגה למשך מספר שניות. אם נוצר משקע, העבר את הנוזל העליון למבחנה חדשה של מיקרו-צנטריפוגה הממולאה מראש והשלך את המשקע. כיול אלקטרודת החמצן הוא שלב מרכזי בפרוטוקול זה ויש לבצעו מדי יום.

ניתן להשלים את כיול האלקטרודה במהלך בידוד המיטוכונדריה. ראשית, הוסיפו 100 milliliters של מים מזוקקים לבקלי 250 milliliter וערבבו בחוזקה במשך 20 דקות. כדי להשריות את המים עם הגז האטמוספרי, כסו את אלקטרודת ה-GRAT בכמה טיפות של 50% potassium chloride.

כעת הניחו חתיכה קטנה של נייר גלגול ריזלה (rizla) כחול על גבי האלקטרודה. לאחר מכן, הניחו חתיכה של ממבנה PTFE על גבי נייר הגלגול.

החילו את הטבעת הפנימית באמצעות applicator הטבעות, ולאחר מכן מקמו את הטבעת החיצונית בחריץ האלקטרודה. חברו את האלקטרודות והרכיבו את בסיס טבעת הפלסטיק הגדולה, את תא המיטוכונדריה ואת צינורות המים. הפעילו את תיבות ה-GRAT והפעילו את תוכנת ה-GRAS.

הוסיפו את המים שעברו שיווי משקל לתא המיטוכונדריאלי. לאחר מכן הוסיפו מגנט ערבוב והפעילו את מערכת הערבוב. לחצו על hardware.

לאחר מכן, ערבבו במהירות. כווןו את המהירות ל-60 ולחצו על "on". לאחר מכן, התחילו ניסוי חדש.

לחצו על calibrate ולאחר מכן על liquid phase calibration. עבור תיבה אחת, שנו את הטמפרטורה ל-37 °C ולחצו על okay פעמיים. כאשר override ישנה ל-okay, לחצו עליו ופתחו את מיכל הגז חנקן.

הכנס את הקצה המחובר למכל החנקן אל תוך התא והשג רמה אפסית של חמצן. לחץ על אישור כאשר המערכת תעבור ממצב override. שאב את המים והוסף 500 µL של EB לתאי המיטוכונדריה.

אטמו את התא באמצעות בוכנה. אם אתם משתמשים במספר קופסאות, חזרו על שלב הכיול עבור כל קופסה. התחילו ניסוי חדש והמתינו כדקה.

כדי לייצב את האות, הוסיפו את הנפח הדרוש של תרחיף המיטוכונדריה כדי להגיע ל-150 micrograms בכל תא. סמנו את האירוע והניחו למערכת לפעול. למשך דקה אחת, הוסיפו 10 microliters של 250 millimolar glutamate מחומם ו-125 millimolar malate, כדי להגיע לריכוז סופי של 5 millimolar glutamate ו-2.5 millimolar malate; סמנו זאת והניחו למערכת לפעול למשך דקה אחת.

זה מוגדר כמצב שני. לאחר מכן, הוסיפו 7.5 µL של 10 mM a DP לריכוז סופי של 150 µM. לאחר מכן סמנו והניחו לזה לרוץ במשך 30 שניות.

מצב זה מוגדר כמצב שלושה. הוסיפו עוד 7.5 µL של ADP בריכוז 10 mM, והמתינו 1.5 דקות. הוסיפו 0.5 µL של oligomycin קר בריכוז 10 mM, כדי להגיע לריכוז סופי של 1 µM, והמתינו שלוש דקות.

מצב זה מוגדר כמצב ארבעה. הוסיפו 1 µL של FCCP קר בריכוז 0.1 mM כדי להגיע לריכוז סופי של 0.2 µM, והמתינו שלוש דקות. מצב זה מוגדר כמצב חמישה.

עם הסיום, הפסק את הניסוי ושמור אותו. רכוש את קצבי הנשימה באמצעות תוכנת ה-raft. הזן את פקטור הנורמליזציה.

במידה ומוסיפים 150 micrograms של חלבון מיטוכונדריאלי, מקדם הנורמליזציה יהיה 0.15. חשבו את קצבי הנשימה המנורמלים עבור מצבי הנשימה השונים. חשבו את יחס הבקרה הנשימתי או ה-RCR על ידי חלוקת מצב שלושה במצב ארבע.

איור זה מציג רישום מייצג של צריכת חמצן על ידי מיטוכונדריה של שריר שלד. לאחר ייצוב אות האלקטרודה, דגימת המיטוכונדריה מתווספת לתא ה-GRAT. במצב שני, הנשימה מתחילה עם הוספת גלוטמט ומאלט.

הוספה של ADP מגבירה את צריכת החמצן. הגדרה של מצב 3. נשימה; ATP syntase נחסם על ידי הוספת oligomycin כדי להגיע לנשימה במצב 4.

לבסוף, מוסיפים FCCP כדי לבצע ביטול צימוד (uncoupling) של הנשימה המיטוכונדריאלית. תרשים זה מציג שיעורי צריכת חמצן מייצגים עבור מצבים 2, 3, 4 וחמש. עבור כל ניסוי מחושב יחס הבקרה הנשימתית או RCR.

RCR הגבוה מ-4 נחשב לעדות להכנה חיונית של מיטוכונדריה. במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור את דגימות המיטוכונדריה בקרח בכל עת. לאחר ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון Western blots, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תכולת חלבונים מיטוכונדריאליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן בידוד מיטוכונדריה משריר שלד, כמו גם של נשימה מיטוכונדריאלית.