זיהוי השפעות של מוטציות BRCA1 על רקומבינציה הומולוגיים באמצעות תאים אקספרס BRCA1 אנדוגני wild-type
17 בפברואר 2011
אנו מספקים שיטה לבדיקת גרסאות BRCA1 ב assay רקמה תרבות המבוססת לתיקון הומולוגיים רקומבינציה של נזק לדנ"א על ידי depleting החלבון BRCA1 אנדוגני מתא באמצעות RNAi והחלפתו מוטציה נקודת BRCA1 המכיל לשנות קידוד.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לבחון וריאנטים ספציפיים בחלבון BRCA1 באמצעות בדיקת רקומבינציה הומולוגית in vitro. דבר זה מושג על ידי החלפת חלבון ה-BRCA1 מסוג הבר (wild type) האנדוגני בווריאנט הנבדק, באמצעות טרנספקציה של RNA מפריע קצר (siRNA) הספציפי ל-BRCA1 ושל פלסמיד לביטוי מחדש של חלבון וריאנט ה-BRCA1 הנבדק בתאים; כשלב שני, ה-siRNA והפלסמיד לביטוי BRCA1 מוטנטי מוחדרים יחד עם פלסמיד לביטוי של חלבון ICN1, הגורם לנזק ל-DNA באתר ספציפי בגנום ה-DNA של התא הנבדק. לאחר מכן, התאים מדגרים למשך יומיים עד שלושה ימים כדי לאפשר לנזק ולתיקון ה-DNA להתרחש; התוצאות המתקבלות מראות האם וריאנטים ספציפיים של חלבון ה-BRCA1 מתפקדים בתיקון DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית, בהתבסס על ניתוח פלואו-ציטומטריה של תאים המבטאים GFP.
טכניקה זו משלבת שתי שיטות מבוססות במטרה ליצור מערכת ורסטילית לניתוח וריאנטים ספציפיים של חלבונים בתיקון נזקי DNA באמצעות רקומינציה הומולוגית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא ששיטות שבוססו בעבר הסתמכו על שורות תאים עם נוקאאוט גנטי של BRCA1. אנו משתמשים בשורת תאים ניתנת לניהול בקלות יותר, הנגזרת מתאי HELOC, המאפשרת דלטור של BRCA1 באמצעות אינטרפרנציה של RNA של החלבון האנדוגני והחזרה של חלבון בדיקה לתאים אלו.
כעת, כאשר אנו מבטאים גרסה מוטגנית של חלבון BRC1, נוכל לבחון רקומבינציה הומולוגית. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה בשל מוות תאי מסיבי במהלך הפרוצדורה. חשוב לקבוע בקפידה את תנאי החיתוך (transection) כדי למקסם את השפעת תגובת הרקומבינציה תוך הגבלת הציטוטוקסיות.
לפני תחילת פרוטוקול זה, הוקם קו התאים hela DR 13 על ידי טרנספקציה של תאי hela עם P-D-R-G-F-P. יש לתחזק את קו התאים בצלחות פטרי של 10 סנטימטר במצע המכיל pur mycin לצורך סלקציה של תאים שעברו טרנספקציה יציבה. תת-המצע לשחלוף בפלסמיד P-D-R-G-F-P ובטרנספורמנטים היציבים מכיל שני אללים לא פעילים של GFP. אלל אחד אינו פעיל עקב הכללת אתר זיהוי של 18 זוגות בסיסים עבור אנזים ההגבלה ISCE one.
ברצף הקידוד שלו, ביטוי של ISCE one בתאים אלו יוצר שבירה של DNA רב-גדילית או DSB באלל השני של GFP שאינו פעיל. החלק ברצף שלו המתואם עם אתר I SCE E one באלל הראשון הוא מסוג בר (wild type). אלל GFP שני זה יכול לתפקד כתור רצף עבור תיקון של DSB באמצעות רקומבינציה הומולוגית, מה שיוביל לאלל GFP פעיל, אשר ניתן לזיהוי בקלות באמצעות ציטומטריית זרימה ביום שלפני הטרנספקציה הראשונה.
השג צלחת של 10 סנטימטר המכילה תאי HeLa DR13 הנמצאים ברמת התלכדות (confluency) של 90% לפחות. בצע trypsinization לתאים ב-1 מיליליטר למשך שתי עד שלוש דקות. עצור את התגובה על ידי הוספת 9 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S וערבב היטב את תגסוס התאים באמצעות פיפטינג. הוסף 40 מיקרוליטר של תאים שעברו trypsinization לכל באער בצלחת של 24 באערים ב-0.5 מיליליטר של D-M-E-M-F-B-S. הדגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס וב-5% פחמן דו-חמצני למשך הלילה.
ביום הראשון, התאים צריכים להגיע לרמת התמזגות (confluence) של בין 40% ל-50%. התחילו את התעתוק (transfection) על ידי ערבוב של ה-irna להדליית b RCA one אנדוגני והפלסמיד המבטא את המוטנט B RCA one בתוך מצע optimum.
בצע את הטרנספקציה באמצעות ליפקטומין בהתאם להוראות היצרן לאחר הטרנספקציה. החזר את התאים לדגירה. החלף את המצע ארבע עד שש שעות מאוחר יותר במצע שאינו מכיל אנטיביוטיקה.
החזירו את התאים לדגירה למשך לילה ביום השני. כדי לנתק את התאים, הוסיפו 0.3 milliliters של ריאגנט trip le trypsin לכל באר. לאחר דגירה קצרה ב-37 degrees Celsius, שחררו את התאיים באמצעות פיפוט של התאים למעלה ולמטה בתוך ריאגנט ה-trypsin. ברגע שה-trypsin פעל, העבירו את התאים מלוח ה-24 באר ללוח של 6 באר המכיל two milliliters של D-M-E-M-F-B-S כדי להפסיק את פעילות ה-trypsin.
הדגרינו את פלטת שש הבארות למשך לילה תחת אותם תנאים כפי שבוצע לפני יומיים מהטרנספקציה הראשונית. הכיני את ה-SIR A, את ה-DNA הפלסמי המבטא את המוטציה BRCA1 ואת הפלסמיד המבטא את ISCE1 ב-62.5 µl של Optum. ערבבי תמיסה זו עם 2.5 µl של LIPECTOMY 2060 ו-2.5 µl של Optum.
יש לבצע טרנספקציה לתאים לאחר דגירה של ארבע עד שש שעות. החליפו את המצע ב-D-M-E-M-F-P-S ללא אנטיביוטיקה. החזירו את התאים לאינקובטור ביום השישי.
יש לעבד את התאים בכל באר באמצעות הוספת 0.5 milliliters של ריאגנט טריפסין. יש לעצור את התגובה על ידי הוספת שני milliliters של D-M-E-M-F-B-S, ולאסוף את התאים על ידי סנטריפוגציה ב-1000 RPM למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. יש להשעות את התאים במיליליטר אחד של D-M-E-M-F-B-S טרי, ולנתח 10,000 תאים לבאר לצורך בדיקת ביטוי GFP.
באמצעות ציטומטריית זרימה, תאים חיים בודדים מופרדים (gated) באמצעות פרמטרי פיזור קדימה וגודל. תאים חיוביים ל-GFP מבודלים באמצעות גלאי הפלורסצנציה של GFP והתוצאות מוצגות כהיסטוגרמה. ניתן לזרוע מחדש את התאים הנותרים לצורך צילום פלורסצנטי.
מיקרוסקופיה של BRCA1 הרצוי מווסתת את המסלול לתיקון שברים דו-גדיליים ב-DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. תאים שעברו תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית ניתנים לזיהוי בקלות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. תשיג של BRCA1 באמצעות RNAi גורם לירידה חדה במספר התאים החיוביים ל-GFP שזוהו.
הפלט מה-FCA הוא היסטוגרמה שבה עוצמת ה-GFP לכל תא מופיעה בציר ה-x ומספר התאים מופיע בציר ה-Y. בהיעדר טרנספקציה של פלסמיד ביטוי אחד ב-SCE, לא מזוהים תאים חיוביים ל-GFP.
התוצאות בעמודות שתיים עד שש נלקחו כולן מתאים שבהם בוצע טרנספקציה של פלסמיד המבטא I SCE 1 ביום השלישי. בסט טיפוסי של תוצאות מניסוי בודד, 15.5% מהתאים הם חיוביים ל-GFP לאחר ביטוי של I SCE 1 ודילול RNAi של ביקורת עבור גן לא רלוונטי; לשם השוואה, דילול של BRCA1 והוספה של וקטור פלסמיד ריק הפחיתו את המרת ה-GFP ל-0.7%. הוספה של BRCA1 מסוג wildtype חיצוני שיקמה באופן מלא את הרקומבינציה ההומולוגית, כפי שזוהה על ידי קבלת 15% עד 16% תאים חיוביים ל-GFP.
באופן דומה, ביטוי של וריאנט אחר בעל משמעות לא ידועה. מוטציית ה-BRCA one I 21 B שיחזרה באופן מלא את תפקוד הרקומבינציה ההומולוגית התלוי ב-BRCA one. להחזרה של המוטנט BRCA one M 18 T הייתה השפעה דומה לזו של ביקרת הווקטור.
מכיוון שוריאנט זה התבטא ברמות דומות לחלבון האנדוגני, הדבר מרמז כי הוריאנט BRCA one M 18 T אינו תפקודי ברקומבינציה הומולוגית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעקוב אחר גדילת התאים; התאים גדלים לאט ובצפיפות (confluency) נמוכה, ולכן יש להפחית את כמות תערובת הטרנספקציה שבה משתמשים. כמו כן, חשוב להסיר את מצע הטרנספקציה במועד.
מצאנו כי בימים שלאחר הטרנספקציה, קיימת רמה גבוהה של ציטוטוקסיות אם המצע כולל אנטיביוטיקה. מסיבה זו, כל המצעים לאחר היום הראשון אינם מכילים אנטיביוטיקה לאחר פיתוחם. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר סרטן השד לחקור את הגנטיקה של וריאנטים של BRC 1 בעלי משמעות קלינית לא ידועה במרפאות אונקולוגיות.
אנו מקווים כי בדיקת ה-BRC one הפונקציונלית שפותחה בעבודה זו תאפשר חיזוי משופר של השפעותיהם של וריאנטים ב-BRC one על הנטייה לסרטן.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לבדיקת וריאנטים של BRCA1 באמצעות תבחנה (assay) של רקומבינציה הומולוגית in vitro. הגישה כוללת דילול של חלבון BRCA1 אנדוגני והחלפתו במוטציה נקודתית ספציפית כדי להעריך את תפקידו בתיקון DNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה של התא
רקע
- BRCA1 חיוני לתיקון נזקי DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית.
- שיטות קיימות מסתמכות לרוב על שורות תאים שעברו מודיפיקציה גנטית.
- מחקר זה משתמש בשורת תאים ניתנת לניהול קל יותר לצורך דלדול של BRCA1.
- השתקת RNA (RNAi) מועסקת להפחתת רמות BRCA1 אנדוגניות.
מטרת המחקר
- להערכת התפקוד של וריאנטים ספציפיים של BRCA1 בתיקון DNA.
- לפיתוח בדיקה רב-שימושית לניתוח מוטציות ב-BRCA1.
- לשיפור שיטות קיימות המסתמכות על שורות תאים עם נוק-אאוט (knockout).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של RNA מפעיל קצר (siRNA) ופלסמידים לתוך תאים.
- שימוש בציטומטריה של זרימה (flow cytometry) לניתוח ביטוי GFP כסמן לתיקון DNA.
- אינקובציה של תאים כדי לאפשר תהליכי נזק ותיקון של DNA.
- הקמה של שורת תאים יציבה להשגת תוצאות ניסיוניות עקביות.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של תאים חיוביים ל-GFP מעיד על רקומינציה הומולוגית יעילה.
- דילול של BRCA1 מוביל לירידה משמעותית בביטוי GFP.
- התוצאות מדגימות את התפקוד של וריאנטים נבדקים של BRCA1 בתיקון DNA.
- ציטומטריית זרימה מספקת ניתוח כמותי של יעילות התיקון.
מסקנות
- השיטה מאפשרת בדיקה יעילה של וריאנטים של BRCA1 בתיקון DNA.
- השימוש בשורת תאים ניתנת לניהול משפר את ההיתכנות הניסויית.
- ניתן ליישם גישה זו כדי לחקור לעומק מוטציות הקשורות ל-BRCA1.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה תפקודית של מוטציות missense ב-BRCA1 היא קריטית להפחתת סיכונים באימות המטרה ולשיפור הביטחון החזוי בבקרת מסלולי תיקון DNA. בדיקת רקומבינציה הומולוגית זו מאפשרת הערכה ישירה של תפקוד הווריאנט במערכת מבוקרת שבה חלבונים אנדוגניים דלדלו, ובכך תומכת בקבלת החלטות מוצקה בנקודות המפנה של הגילוי והתרגום הקליני. גישה זו משפרת את מיון הפורטפוליו על ידי הבחנה בין וריאנטים תפקודיים לבין וריאנטים שאינם תפקודיים של BRCA1 הרלוונטיים למסלולי פיתוח באונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מכניסטית של השפעת וריאנטים ב-BRCA1 על תיקון באמצעות רקומבינציה הומולוגית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד השפעות ספציפיות לווריאנט על רקע של טיפוס פרא (wild-type).
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי בסיווג וריאנטים עבור אסטרטגיות טיפוליות בהמשך.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מערכת תאית מתוקפת להערכה כמותית של פעילות תיקון DNA באמצעות קריאת GFP.
- מייצב את תנאי הבדיקה באמצעות דלטוריזציה חריפה (acute depletion) והוספה מחדש (add-back), ובכך ממזער התאמות מפצות.
- מאפשר כימות הניתן לשחזור המבוסס על ציטומטריה של זרימה, המתאים לסריקה השוואית של וריאנטים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים של וריאנטים פונקציונליים עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים במחקר אונקולוגי.
- תומך ברצף העבודה מהערכת וריאנטים בשלב הגילוי ועד לבחירת מודל פרה-קליני.
- מפחית את הסיכון הביולוגי על ידי הבהרת תפקוד הווריאנט לפני מחקרים in vivo.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני בכך שהיא מאפשרת הערכה תפקודית כמותית ומוקדמת של וריאנטים של BRCA1, ובכך מספקת מידע להחלטות הנוגעות הן לתיקוף המטרה והן לתיעדוף מועמדים מובילים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מנגנוני תיקון DNA המונעים על ידי וריאנטים ועל שלמות המסלול.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור המבוססות על GFP לצורך השוואה בין וריאנטים.
- אנליזה: מספקת היסטוגרמות של ציטומטריית זרימה ואחוזי תאים חיוביים ל-GFP כנתוני קריאה יישומיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתוני תפקוד של וריאנטים לבחירת סממנים ביולוגיים (biomarkers) ומערכות מודל באונקולוגיה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה לגנים אחרים הדורשים אנליזה תפקודית רססיבית במערכות תאיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתפקוד של וריאנטים ובתיקוף של מטרות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה להערכת וריאנטים, ובכך מפחית גורמים מתבלבלים הנובעים ממוטציות מפצות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת (go/no-go) תוכניות טיפוליות מבוססות וריאנטים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של BRCA1 ומטרות רלוונטיות אחרות לתיקון DNA.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ב-RNAi, טרנספקציית פלסמידים וניתוח ציטומטריה זרימה.
- דורש גישה לקווי תאים יציבים ולתשתית ציטומטרית אנליטית.
- מצריך אופטימיזציה קפדנית של תנאי הטרנספקציה כדי למזער ציטוטוקסיות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית לשחזור ולניתנות להשוואה של הנתונים.
- התאמה למטרות גנים אחרות עשויה לדרוש שינויים בפרוטוקול שנתמכים על ידי מדדים פונקציונליים.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
2:01
Preparation of Cell Line with an Integrated Recombination Substrate
3:04
Transfection to Deplete Endogenous BRCA1 and add back Mutant BRCA1
5:19
Analysis of Transfectants
6:07
Analysis of the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination via GFP-Expression
7:54
Conclusion
