בסיוע מחשב ויזואליזציה בקנה מידה גדול כימות המוניים הלבלב איילט, התפלגות גודל ואדריכלות

המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף נתונים מייצגים ובלתי מוטים בתוך מדגם מוגבל, ולנתח במדויק את המבנה התלת-ממדי המורכב של הרקמה. זאת על ידי לקיטת פרוסות וירטואליות של חתכי לבלב שנצבעו כימית ובשיטת אימונוהיסטוכימיה. לאחר מכן, הפרוסות הווירטואליות נמדדות כמותית באמצעות מאקרו IHC virtual slice בתוכנת Image J, והנתונים מנותחים באמצעות סקריפטים שנכתבו עבור Mathematica.

בשלב הבא, מתבצעת שחזור תלת-ממדי של הפרוסות הווירטואליות באמצעות Image J. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא לכידה של ערימה של תמונות איים בודדות באמצעות תוכנת slide book ומיפוי ידני של ערימות התמונות בשלושה ממדים באמצעות stereo investigator. בסופו של דבר, ניתן להשיג ארכיטקטורה מדויקת של האיים עם קואורדינטות תלת-ממדיות עבור כל תא באי, באמצעות שיטה משולבת של דימוי תלת-ממדי ומיפוי ידני. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי המחקר של השמנה וסוכרת, כגון כיצד תנאים פיזיולוגים ופתופיזיולוגים משפיעים על מסת תאי בטא בלבלב, על פיזור האיים ועל הארכיטקטורה שלהם.

ההשלכות של טכניקה זו הן רלוונטיות לאבחון או לטיפול בהשמנה ובסוכרת (Diabetes Mellitus), מאחר שהבנה טובה יותר של השינויים במסת תאי בטא תסייע בפיתוח ובהערכה של התערבויות טיפוליות. אף שהשיטות המתוארות במחקר הנוכחי מספקות תובנות ספציפיות, ניתן להחיל את הניתוח האימונוהיסטוכימי הדינמי של הלבלב גם על מגוון רחב של אורגניזמים ורקמות אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה ללמוד את שלבי הניתוח בעזרת המחשב.

בשל המורכבות של ניתוח מערכי נתונים גדולים כל כך בשני ממדים ובשלושה ממדים. התחילו הליך זה על ידי הנחת סרטייה נקייה המכילה נתיך שלם של לבלב שעבר צביעה כימית אימונוהיסטוכימית במחזיק של מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פתחו את תוכנת ה-stereo investigator והציגו את הדגימה על ידי לחיצה על acquisition.

לאחר מכן, בצעו דגימה חיה (live image). קבעו את רמות החשיפה עבור כל ערוץ באמצעות חלון ההיסטוגרמה של הווידאו, המציג את עוצמת הפלואורסצנציה. בדוגמה זו, ערוץ שני משמש עבור DAP, ערוץ שלוש עבור GFP, ערוץ ארבע עבור RFP, ערוץ חמש עבור sci five וערוץ שש עבור SCI seven.

באמצעות חלון הגדרות המצלמה, כוון את רמת החשיפה כך שעצימות הפלואורסצנציה תדע דעיכה. בקצה הימני של ההיסטוגרמה של הווידאו, ניתן להתמקד בתמונה באמצעות גלגל המיקוד של המיקרוסקופ. לפני יצירת פרוסה וירטואלית, סמן את מתאר הדגימה על ידי לחיצה על המסך בנקודה הרחוקה מהדגימה, שתסמן נקודת ייחוס.

לאחר מכן, לחצו מסביב למתווה של הדגימה כאשר המתאר הושלם. לחצו לחיצה ימנית ובחרו ב-close contour כדי לחבר את נקודות ההתחלה והסיום; לאחר סגירת המתאר, צלמו פרוסה וירטואלית עבור הדגימה על ידי בחירה ב-acquisition, ולאחר מכן ב-acquire virtual slice. כאשר נפתחות אפשרויות חלון הפרוסה הווירטואלית, בחרו ב-high speed acquire, וכן בטלו את ה-manual.

בצעו מיקוד על ידי ביטול סימון התיבה שליד manual. שמרו את הקובץ. כיילו את ה-prefo על ידי לחיצה ימנית ובחירה ב-add to focus site list.

בצעו מיקוד ידני של מספר מקטעים אקראיים בתצוגה המקדימה של הפרוסה הווירטואלית. לאחר מיקוד של מספר אתרים, התחילו את הפרוסה הווירטואלית על ידי לחיצה ימנית ובחירה ב-Start virtual slice with prefo. לאחר השלמת הפרוסה הווירטואלית עבור הדגימה הראשונה, עברו לערוץ הבא והתאימו את החשיפה בהתאם. יש לחזור על הליך זה עבור כל ערוץ לצורך כימות של eyelets. עבדו את התמונות באמצעות מאקרו של ImageJ בשם I-H-C-V-S, אשר תחילה מכין את התמונות הטעונות לניתוח ולאחר מכן מכמת מאפיינים של eyelets, כגון הרכב תאי.

מאקרו ה-I-H-C-V-S מפצל את הערימה (stack) לערוצי הצבע המתאימים לה. בתוכנת Image J, הוא ממיר כל תמונה למסכה של שחור-לבן ב-8 ביט. לאחר סף עוצמה אוטומטי (automatic intensity thresholding), הוא מחבר את תמונות הערוצים הנפרדות באופן אריתמטי למסכה מרוכבת.

ניתוח החלקיקים המובנה של Image J בתמונה המורכבת יזהה אזורים של עניין (ROIs), תוך החרגת חלקיקים הקטנים מתא בטא אחד. כימות ה-ROIs באמצעות Image J יפיק גיליון נתונים של פרמטרי התאים.

שמרו את התוצאות המצטברות בגיליון אלקטרוני של Excel. אחסנו נתונים כגון היקף שטח, עיגוליות, קוטר fer ומרכז ה-eyelet עבור כל eyelet, יחד עם המספרים התואמים המסומנים בתמונה. ניתן לבצע ניתוח חישובי של פרמטרים אלה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי לחשוף מידע הכולל את פיזור ה-eyelets וניתוח תדירויות, בצעו שחזור תלת-ממדי של פרוסות וירטואליות על ידי הרצת סקריפט הממיר את כל תמונות ה-JP two בספריה לקבצי TIF, שהוא הפורמט המשמש לבנייה וכמותיזציה של ערימות תלת-ממדיות מהפרוסות הוירטואליות.

כאן נעשה שימוש בסקריפט הנקרא I MJ two two tiff. העתיקו את הסקריפט לספריה המכילה את תמונות ה-JP two. הפעילו את הסקריפט באמצעות מעטפת Linux על ידי הקלדת dot slash I am JP two two TIFF בקונסול ולאחר מכן לחיצה על enter.

לאחר שכל התמונות שצולמו הומרו מקבצי JP2 לקבצי TIFF, הן מוכנות לניתוח ב-Image J. באמצעות Image J, פתחו את כל התמונות עבור הדגימה הראשונה, שבמקרה זה הן לבלב עוברי אנושי, ומזגו אותן לתמונה אחת על ידי בחירה ב-Image, לאחר מכן Color, ובסוף Merge Channels. חזרו על תהליך זה עבור כל אחת מהדגימות. כאשר כל הדגימות שולבו כתמונות בודדות, נקו את התמונות על ידי בחירת אזורים בלתי רצויים באמצעות כלי בחירת הפוליגון (polygon selections tool).

מלאו אותם על ידי בחירה ב-edit, ולאחר מכן ב-fill. המירו כל תמונה לתמונת צבע RGB. לבסוף, צרו stack מהתמונות, שלאחריו ניתן יהיה לבצע להן יישור נוסף באמצעות תוסף ה-stack reg.

בסופו של דבר, מיזוג הערוצים ושילוב התמונות יוצרים מונטאז' בתלת-ממד של כל העיןलेट्स (eyelets) בלבלב כולו. כדי לאסוף מחסניות תמונות (image stacks), מקמו את עיןלקי הלבלב המורכבים כדגימה שלמה תחת המיקרוסקופ. הוסיפו מים במידה ואתם משתמשים בעדשה אובייקטיבית לטבילה במים.

פתחו את תוכנת ה-slide book, וגשו לבקרת הלכידה והמיקוד על ידי לחיצה על control פלוס shift פלוס E בחלון בקרת המיקוד. הגדירו את העדשה לאובייקטיב של 20 פעמים או 40 פעמים, בהתאם לגודל ה-eyelet. כדי להשתמש בעדשת העין של המיקרוסקופ לאיתור ה-eyelets, הגדירו את ה-bin לשתי פעמים והגדירו את סט המסננים ל-user one.

בחלון בקרת המיקוד, יש להגדיר את בחירת הפליטה ל-100%Eyes ב-neutral density להגדרה של לחיצה אחת GFP ey, ולאחר מכן פתח את הרצפה כדי להדמיות הדגימה ב-slide book, חזור לחלון בקרת המיקוד והעבר את סט הפילטרים למצב fix. לאחר מכן לחץ על G-F-P-D-S. השתמש בג'ויסטיק כדי למרכז את ה-eyelet בחלון camera one בצורה הטובה ביותר.

בצעו פוקוס לעומק הנמצא בקירוב במרכז ה-eyelet, שם ניתן להבחין בתאים בקלות. בחלון בקרת הפוקוס, בחרו ב-zab. השתמשו בבקרת המיקרוסקופ כדי לגלול לעומק העליון ביותר של ה-eyelet שבו ניתן להבחין במאפיינים בבירור, ולחצו על set top.

גללו לתחתית ה-eyelet ולחצו על set. לביצוע לחיצה תחתונה, לחצו על go. כדי לחזור לנקודת הייחוס בחלון הלכידה, לחצו על advanced, ולאחר מכן על alternate ב-channel mode.

הגדירו את מקדם ה-bin לפי שניים ואת סוג הלכידה ל-3D בצד ימין של החלון, לחצו על use top and bottom positions ועל return to center volume after capture. הגדירו את גודל הצעד (step size) לשלושה. הגדירו את ה-filter set ל-live מתחת לתיבת ה-filter set.

בחר את DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U וחמשה DSU של SCI. עבור כל אחד מהם, לחץ על find best תחת adjust exposure. לאחר מכן לחץ על test כדי לוודא שהחשיפה שנבחרה מתאימה.

לחצו על start כדי להתחיל בצילום. עם סיום הצילום, התאימו את הרמות לפי הצורך ושנו את הצבע המוצג עבור RFP ללבן. שמרו את השريחה ועברו לתצוגת export TIFF series.

הקלידו את שם השקופית עם מקף בסופה ושמרו אותה. נוצרים עשרות קובצי TIF בודדים, לכן עשוי להיות מועיל לשמור כל ערימת תמונות של eyelets בתיקייה נפרדת. כדי למפות את ערימות התמונות, פתחו את תוכנת ה-stereo investigator.

בצעו ויזואליזציה של התמונה על ידי פתיחת ערימות התמונות בתפריט קנה המידה של התמונה. הגדירו את המרחק בין התמונות לשלושה מיקרונים כדי לתקן עבור כיפוף פי שניים. ב-slide book בחרו ב-override X and Y scaling והשתמשו ב-specified עבור מקור קנה המידה של x ו-Y.

הזינו 0.65 עבור מרכז X ומרכז Y, ובצעו זום לתמונה על ידי לחיצה על כפתור הזום; לאחר מכן, סמנו תא אחד לפחות במרכז האיס (ilis) המבוקש בחלון המאקרו. בשימוש בסמן המתאים, תאי בטא יופיעו בירוק, תאי אלפא יופיעו באדום ותאי דלתא יופיעו בלבן.

סמנו את התאים במרכז הגרעין שלהם, שיופיע בצבע כחול אם הדגימה נצבעה ב-DPI. השתמשו בסמן שתיים (Marker two) לסמיון תאי בטא, בסמן חמש (Marker five) לסמיון תאי אלפא, ובסמן שש (Marker six) לסמיון תאי דלתא. לאחר שסומן לפחות תא אחד, הציגו את התצוגה האורתוגונלית באמצעות האייקון בתפריט העליון, וסמנו את Z filter ו-symmetric.

יש להגדיר את הטווח ל-15.00. החל מ-0.0 Z, גללו דרך הלולאות באמצעות גלגלת העכבר וסמנו כל תא עם הסמן המתאים; סמנו כל תא פעם אחת בלבד במרכז עומקו. עם סיום הסימון של כל רמות ה-Z, ניתן לבטל את הסימון בתיבת הבחירה של מסנן ה-Z.

פעולה זו תציג את כל הסמנים מכל רמות ה-Z. לאחר שכל תא סומן, שמור את הקובץ כקובץ DAT. לאחר מכן, עבור ל-file export tracing.

שמרו את השרטוט כקובץ TXT. לבסוף, לחצו על new data file כדי לנקות את מרחב העבודה לפני ניסיון מיפוי של אי-עלים (eyelets) חדשים. הכנת פרוסות וירטואליות מדגימה של לבלב שצבעה בשיטה אימונוהיסטוכימית מאפשרת בחינה של תאי האנדוקרין מסוג אלפא, בטא ודלתא בכל הלבלב יחד כאיים; ניתן לראות צביעה אימונוהיסטוכימית לאינסולין בירוק, גלוקגון באדום, סומטוסטטין בלבן ו-dap בכחול.

לאחר מכן הומרו התמונות למסכת שמונה ביטים באמצעות סף אוטומטי (automatic thresholding). מוצגת כאן תמונת מיזוג מורכבת. עם זאת, מיפוי התפלגות ה-eyelet באמצעות פרוסה וירטואלית מאפשר גם ניתוח בודד בערוצים נפרדים.

כאן מוצגות תצפיות של כל ערוץ כדי לחשוף את תאי הדלתא, תאי הבטא ותאי האלפא. ניתוח חלקיקים בוצע על מסכה מורכבת המציגה כל מבנה של eyelet ממוספר ומודגש בכחול. פלט ניתוח החלקיקים של המסכות המורכבות הוא טבלת נתונים המכילה פרמטרים כגון שטח, היקף, עגוליות וקטרים שונים עבור כל eyelet שזוהה, להם מזהים (IDs) התואמים לתגים הממוספרים במסכה המורכבת.

ניתוח רחב היקף של תמונות אלו מוביל להפקה של היסטוגרמות של מספר האיליס (eyelet) הכולל והתפלגות הגודל שלהם, וכן להשוואות מפורטות של שטחי תאי אלפא, בטא ודלתא. מיפוי של איליס וניתוח מתמטי של ההרכב והארכיטקטורה התאוויים יכולים לחשוף מישור מוקד בודד מתוך ערימה משוחזרת בתלת-ממד של תמונות של איליס אנושי שהועלו ל-Stereo Investigator. כאן, תאי בטא מופיעים בירוק, תאי אלפא באדום, תאי דלתא בלבן וגרעינים בכחול.

בעקבות לכידה של eyelets מובחנים, תאי alpha, beta ו-delta מסומנים כאן במישורי חיתוך שונים; תמונות פלואורסצנטיות ונתוני המפות התואמים מוצגים עבור שלושה מישורי מוקד שונים במרווח של 10 microns. לאחר שסומנו תאי alpha, beta ו-delta במישורים השונים, ניתן להציג את ה-eyelet בתלת-ממד. מוצגת כאן שחזור תלת-ממדי של eyelet חתוך לרבע, המבוסס על קואורדינאטות שהתקבלו באמצעות מיפוי eyelet.

בנוסף, ניתוח מתמטי אוטומטי של eyelets שמופו יכול להציג את ההרכב התאי ואת הארכיטקטורה. כאן מוצגת התדירות היחסית של מרחקים בין תאים עבור שני תאים באוכלוסיית תאים בודדת. מוצגת גם התדירות היחסית של מרחקים בין תאים עבור שתי אוכלוסיות תאים שונות.

מוצגות גם ההסתברויות המצטברות של התפלגויות המרחקים בין תא לתא עבור תאי אלפא לאלפא, בטא לבטא ודלתה לדלתה. ניתן לבצע את מבחן Kolmogorov-Smirnov או KS על הסתברויות אלו כדי לקבל את מרחקי ה-KS המתאימים. ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן לבצע דימוי וניתוח בקנה מידה רחב של נתח רקמה שלם תוך ארבע שעות.

ניתן לבצע שחזור תלת-ממדי של בלוק רקמה תוך 30 דקות. לבסוף, ניתן להשלים הדמיה תלת-ממדית ומיפוי ידני תוך ארבע שעות אם הפעולה מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להתחיל עם צביעה אימונוהיסטוכימית באיכות גבוהה של החתכים.

דיוקם של הניתוחים הבאים יהיה תלוי כולו בנתונים הגולמיים. כמו כן, ודאו שבמחשביכם יש לפחות שמונה גיגה-בייט של RAM כדי לעבד ניתוח בקנה מידה גדול כזה לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים, לא רק בתחומי ההשמנה והסוכרת, אלא באופן נרחב בתחומים רבים אחרים המשתמשים בניתוח פתולוגי סטנדרטי.

שיטה זו עשויה להיות שימושית במיוחד כאשר זמינות הדגימות מוגבלת. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכושו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לאסוף נתונים מייצגים ולא מוטים בתוך גודל מדגם מוגבל באמצעות טכניקות סטנדרטיות. בחירה של אזור ספציפי בלבד עשויה שלא להיות מייצגת של התמונה המלאה, כפי שהדגמנו במחקר שלנו על התפלגות האיים בלבלב.