בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ספריית מוטציות אקראית עבור רצף DNA מטרה נתון, ולזהות ולאפיין במהירות מוטנטים באמצעות ברירה תפקודית חצי-כמותית. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספורמציה של פלסמיד עם מקור שכפול אחד המכיל את רצף המטרה לתוך זן המוטטור של E. coli. לאחר פריסה על מצע ודגירה של התאים למשך לילה, הם נאספים והפלסמיד המטרה מבודל כדי להשיג את ספריית המוטנטים; לאחר מכן, ספריית המוטנטים עוברת טרנספורמציה לתוך זן קריאה (readout strain) כדי לאפיין את המוטציות בחלק השני של הפרוטוקול. מכינים פלטת צמיחה במדורג (gradient growth plate) וטוענים תרביות חיידקים של זן הקריאה לתוך צלחת פטרי נפרדת המכילה אגר רך.

השלב האחרון של הפרוצדורה הוא להעביר את תרביות חיידקים אלו לגרדיאנט באמצעות טביעה. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות שינויים בפרופיל הפנוטיפי של רצף מטרה נתון, וזאת באמצעות הבדלים בצמיחה על גרדיאנט של תרופה. סרטון זה מציג שיטה לאבולוציה מכוונת של חלבונים ב-e coli.

תהליך זה מחקה את האבולוציה הטבעית ביצירת ספריות רנדומליות של חומרים מזינים, ולאחריה ברירה המגבילה את השונות הזו. לפיכך, הוא משפר את היכולת שלנו לייצר פעילויות ביוכימיות חדשות למטרות תעשייתיות או ביו-רפואיות. להליך זה שני מרכיבים: יצירת ספריית מוטציות רנדומלית וברירה פונקציונלית להשגת מוטציות של תגביר תפקוד (gain of function). את ההליך זה תדגים ג'ניפר אלן, טכנאית מהמעבדה שלי.

לפני תחילת פרוטוקול זה, יש להכין תאי JS 200 בעלי כשירות אלקטרופורית המבטאים וריאנט בעל נאמנות נמוכה (low fidelity) של DNA polymerase I, או low fidelity pol I, שהוכנו מראש כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב; תאים אלו מכילים אלל רגיש לטמפרטורה של pol I, כך שפעילות low fidelity pol I היא הדומיננטית ב-37 °C. יש לבנות פלסמיד מטרה המכיל מוצא רפליקציה (origin of replication) של coli 1, כאשר רצף המטרה cloned סמוך למוצא הרפליקציה; low fidelity pol I מתחיל את רפליקציית הפלסמיד coli 1, ובכך מחדיר מוטציות כדי להתחיל את התהליך המוטגני.

ערבבו 40 µL של תאים בעלי יכולת טרנספורמציה חשמלית (electro competent cells) ובין 30 ל-250 ng של DNA פלסמי מטרה במרווח של 2 mm. בצעו פולס של אלקטרופורציה לתערובת באלקטרופורטור במתח של 1800 V. בדקו את קבוע הזמן או ה-TC כדי להבטיח תנאי אלקטרופורציה אחידים לכל דגימה.

באופן אידיאלי, ה-TC שווה לחמישה עד שישה מילישניות. יש לאפשר לתערובת ה-DNA של התאים להתאושש ב-1 mL של מרק LB למשך 40 דקות ב-37 °C תחת ניעור ב-250 RPM. השג צלחת פטרי LV agro במידה של 100 מ"מ, שחוממה מראש ל-37 °C ומכילה אנטיביוטיקה מתאימה לסלקציה של שני הפלסמידים; פזר את התאים שהתאוששו בדילול מתאים כדי להגיע לריכוז קרוב למסך (lawn), המוגדר כמספר מובחן אך בלתי ניתן לספירה של מושבות, כפי שמוצג בדוגמה זו.

לאחר דגירה לילה, קצרו את המושבות החיידקיות מפטריות הפטרי עם מצע LB broth. בודדו את הפלסמיד, ה-DNA מהתאים שנקצרו; ה-DNA של הפלסמיד שהתקבל מהווה את ספריית המוטנטים האקראית.

בצע עיכול רסטריקציה על ידי חיתוך של ספריית הפלסמידים עם אנזים רסטריקציה המליניארי את הפלסמיד המטרה ואת הפלסמיד העמוד (pole plasmid). הרץ ג'ל אנליטי של אגרוז (agarose) על ה-DNA הפלסמידי המבודד כדי לאשר את האיכות והכמות. לאחר אימות הפלסמידים, עכב מיקרוגרם אחד מהספרייה עם אנזים רסטריקציה המליניארי את הפלסמיד העמוד, אך אינו חותך את הפלסמיד המטרה.

לאחר השלמת עיכול ההגבלה, נקה את הספרייה באמצעות ערכה לטיהור DNA. לבסוף, בצע טרנספורמציה של הספרייה הנקייה למאבט קריאה (readout strain) כדי לאפיין את המוטציות. כדי להתחיל בהכנת המעבר (gradient), סמן 10 נתיבים במרווחים שווים לאורך קצה אחד של תחתית צלחת הפטרי המרובעת.

הנח את הצלחת בשיפוע כך שהקצה המסומן בתחתית מוגבה ב-7 millimeters. שפוך 25 milliliters של lb agar חם, המעורבב היטב עם ריכוז מתאים של גורם הברירה, אל תוך הצלחת המשופעת. זוהי השכבה התחתונה של המדרג.

ודאו שגרגיר ה-LB agar מצפה את צלחת הפטרי כך שבקצה המסומן והמוגבה של הצלחת יהיה כמילימטר אחד של LB agar, ובחלק הנמוך יהיו כثمانה מילימטרים. כסו את הצלחת עם המכסה KU לצורך אוורור והמתינו 10 עד 15 דקות להתגבשות האגר. לאחר שהשכבה התחתונה של ה-LB agar התקשחה, העבירו את הצלחת למשטח שטוח.

בשלב הבא, מזגו 25 milliliters של lb agar חמים ללא הסוכן הבורר כדי לכסות את פני השטח של ה-agri הראשון, תוך וידוא כי כל השכבה התחתונה מכוסה. כסו את הצלחת עם המכסה KU לאוורור, ולאחר מכן המתינו 10 עד 15 דקות עד שה-agri יתקשה כדי לבצע את העברת החותמת של החיידקים. ראשית, השגימו תרביות חיידקים של זן הקריאה (readout strain) ודללו אותם כך שיהיו בעלי צפיפויות תאים זהות עם צפיפות אופטית ב-600 nanometers של פחות מ-1.0.

בשלב הבא, העבירו שני מיליליטר של אגר רך נוזלי שהגיע לשיווי משקל בטמפרטורה של 42 °C לתחתית של צלחת פטרי עגולה בקוטר 100 מילימטר, טפטפו באמצעות פיפטה 40 µL של תרבית חיידקים אל תוך האגר הרך ולאחר מכן ערבבו על ידי נעירה של הצלחת. צפו את הקצה הארוך של זכוכית המיקרוסקופ בתערובת האגר הרך. לאחר מכן, יישרו את הקצה המצופה של הזכוכית עם הסימון התחתון שעל צלחת המדרג.

השחית את הזכוכית אל פני השטח של האגאר. מגע עדין מספיק כדי להעביר פס של אגאר רך אל פני השטח של המדרג. לאחר מכן, את הזכוכית מניחים בצד לצורך ניקוי ושימוש חוזר.

חזור על תהליך זה. את שאר הדגימות ובקרות הניסוי יש לכלול בכל צלחת גראדיאנט. אם מריצים מספר גראדיאנטים, הדגר את צלחת הגראדיאנט במצב הפוך (מלמעלה למטה) למשך לילה ב-37 degrees Celsius; זמני וטמפרטורות ההדגרה עשויים להשתנות עבור זנקי חיידקים שונים המשמשים לקריאה, אך הדגרה למשך לילה ב-37 degrees Celsius מספיקה בדרך כלל לצמיחה נראית לעין.

לבסוף, בצעו דימות וניתוח של צמיחת התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. מוצגות כאן תמונות של זן קריאה (readout strain) שעבר טרנספורמציה עם P-G-F-U-V לא מוטגנזי או עם ספריית מוטנטים של PG FPUV שעברו ארבעה סבבים של מוטגנזה. מושבות כהות או עמומות מעידות על פלסמיד המכיל מוטציות המבטלות את פעילות ה-GFP.

איור זה מייצג את תדירות המוטציות לאורך הרצף הניטרלי של הפלסמיד המטרה במרווחים של 100 זוגות בסיסים. שים לב כי המוטציות מתרחשות לאורך כל רצף הפלסמיד, אך בתדירות הגבוהה ביותר בקרבת נקודת התחלת השכפול (origin of replication). כאן מוצג גידול של מוטנטים אל מול מדרג של תרופה.

המרחק שבו גדלו המושבות לכיוון קצה המדרג מעיד על פרופיל עמידות דיפרנציאלי לתרופה בקרב המוטנטים. בדוגמה זו, ספריות פלסמידים של האנזים האנושי oxidative demethylase ABH two נסרקו כדי למצוא מוטנטים בעלי עמידות מוגברת ל-methyl methane sulfonate באמצעות מדרגי ברירה של התרופה. ספריות אלו, המייצגות שני וארבעה סבבים של פרוטוקול המוטגנזה, מוצגות בהשוואה לטיפוס הפרא (wild type) ההורי ולווקטור ריק.

הקו הלבן מציין את הסף שמעליו בודדו מושבות מוטנטים בודדות. לצורך ניתוח פנוטיפי נוסף, מוטנטים של beta-lactamase, מסוגי R 1 64 H ו-E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R שזוהו בעבר באמצעות מוטגנזה של P one בנאמנות נמוכה ובסלקציה של astri ו-m, מוצגים על מדרג ריכוזים של 0.4 µg/mL ו-4 µg/mL של Cefotaxime. הגנה מפני cefotaxime מעידה על פעילות של extended spectrum beta-lactamase.

שימו לב כי אנזים ה-beta-lactamase מסוג הבר (wild type) אינו מעניק הגנה ביחס לתאים המבטאים וקטור ריק. לפיכך, מוטנטים אלו מייצגים הסתגלות או אבולוציה של פעילות ביוכימית חדשה. כאן הצגנו שילוב עוצמתי של מוטגנזה וברירה תפקודית עבור יצירה זו של פעילויות ביוכימיות חדשות.

ניתן להשיג ברירה פונקציונלית באמצעות ברירה באמצעות תרופות או באמצעות קומפלמנטציה גנטית, והיא מנצלת את יכולתנו ליצור שונות גנטית רבה. ייתכן שיהיה צורך להגביל את המוטגנזה לרצף נתון על מנת למטב פעילויות חלבון קיימות או עבור מוטגנזה מכוונת לאתר. ניתן לבצע פעולות אלו בקלות באמצעות שיבוט.

בנוסף, ניתן להפריד את התהליך של מוטגנזה מבחירה פונקציונלית כדי להשיג התקפות חתימה (signature attacks) או עקבות מוטציוניים.