במושבה שמרים והטבעה שיטה
22 במרץ 2011
שיטה להטבעת מושבות שמרים המאפשר חתך של מיקרוסקופ אור אלקטרונים. פרוטוקול זה מאפשר קביעה של חלוקת תאים sporulated ותאי pseudohyphal בתוך מושבות מתן כלי חדש לקראת הבנת הארגון של סוגי תאים בתוך קהילה פטרייתי.
המטרה הכללית של הליך זה היא להטמיע מושבות שמרים. הדבר נעשה תחילה על ידי הסרת מושבה והאגר שמתחתיה מלוח אגר, הנחתה על מספר טיפות של אגר מומס וכסייתה במהירות באגר מומס נוסף. לאחר מכן, עודפי אגר נגזזים מהמושבה כדי להקטין אותה מספיק כדי שתוכל להיכנס לתבנית.
לאחר מכן מקבעים, צובעים, מייבשים ולבסוף מחדירים את המושבה המוטמעת ב-AER בשרף spurs. את הבלוק מניחים בתבנית עם שרף spurs נוסף, מדגריים עד להתקשחות ולאחר מכן מבצעים חיתוך. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את התפלגות סוגי התאים בתוך מושבת שמרים באמצעות מיקרוסקופיה של אור או אלקטרונים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, הוא שהיא מאפשרת לקבוע את המבנה הפנימי של המושבה. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות המיקרוביאלית, כגון התפלגות סוגי התאים בתוך מושבות. שיטה זו סיפקה תובבנות לגבי המבנה של מושבות croce CAC, אך סביר להניח שניתן להחילה גם על מיקרואורגניזמים אחרים.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהטיפול במושבות והטמעתן עשויים להיות קשים ללמידה מפרוטוקול כתוב. הרעיון לשיטה זו נבע מנתונים גנטיים שפרסמנו בשנת 2002, אשר הצביעו על כך שנבגים אינם מפוזרים באופן אחיד במושבות. התאמנו שיטה לחיתוך מושבות שפותחה על ידי engelberg במעבדה של fin.
אם כן, נתחיל. התחילו בביקורי שמרים מסוג Wild S visi על מצעי אגר בטמפרטורה של 30 מעלות עד להופעתם של כ-300 מושבות. בעזרת מרחקה צרה, הסירו מהצלחת מושבות בעלות קוטר של מילימטר אחד עד שניים, אחת לאחר אחת.
לאחר מכן, באמצעות טיפ של פיפטה של 1 מיליליטר, הניחו מספר טיפות של 2% agar בטמפרטורה של 42 °C על זכוכית מיקרוסקופ, והניחו מיד את המושבה על ה-agar כאשר הפנים הפונה כלפי מעלה, לפני שה-AER מתמצק. הניחו מספר טיפות נוספות של agar על המושבה והמתינו שה-agar יתמצק, תוך וידוא כי כל המושבה, כולל חלקה העליון, עטופה ב-agar. בכל שלבי הפרוטוקול הבאים השתמשו בלהב תער.
גזמו את ה-AER מסביב למושבה והניחו את בלוק ה-AER המכיל את המושבה בתוך מבחנה עם פקק הברגה מborosilicate בנפח 3.5 milliliter המכילה מקבע של 2%paraform aldehyde ו-2%glutaraldehyde. יש לעבד את המושבות אחת אחת כדי למנוע התייבשות, אך ניתן להניח עד 10 מושבות באותה מבחנה. השאירו את המושבות למשך שבעה ימים בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius.
לאחר שבוע, הסירו את חומר הקיבוע ושטפו את מושבות ה-agri פעמיים, תוך שימוש בכ-1.5 milliliters של sodium citrate 0.15 molar ב-pH 7.2, והדגירו על קרח לאחר כל שטיפה למשך 15 דקות ללא ערבוב. לאחר מכן, חזרו על השטיפה פעמיים נוספות.
השתמשו ב-1.5 milliliters של OS buffer בריכוז one X, המורכב מ-100 millimolar mono potassium phosphate ו-10 millimolar magnesium chloride ב-pH 6.0, והדגירו על קרח למשך חמש דקות לאחר כל שטיפה. לאחר מכן, באותה מבחנה, בצעו את טיפול האוסמיום ואת השטיפות המפורטים כאן ובחלק הכתוב של פרוטוקול זה. לאחר מכן, שוב באותה מבחנה, בצעו את שלבי ההתייבשות המפורטים כאן ובפרוטוקול הכתוב המצורף, מוקדם למחרת בבוקר.
הכינו את רכיב ה-spurs כפי שמוצג כאן ובפרוטוקול הכתוב המצורף. שטפו מיד את בלוקי ה-agri חמש פעמים למשך 10 דקות כל פעם עם 1.5 milliliters של ethanol 100% בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת ה-ethanol האחרונה, הסירו כמות ethanol מצומצמת בלבד, כך שבלוק ה-agri יישאר מכוסה.
באמצעות פיפטת פסטור, העבירו כ-0.5 milliliters של spurs reagent אל תוך הבקבוק וסובבו אותו על גלגל במהירות נמוכה למשך 15 דקות. לאחר הסיבוב, הניחו לבקבוק לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הסירו את התמיסה לחלוטין.
לאחר מכן, הוסיפו 1.5 milliliters של spurs reagent כדי לכסות את ה-agri block. שוב, סובבו את המבחנה על גלגל למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר והניחו לה לעמוד למשך 30 דקות. חזרו על שטיפה זו.
חזרו על השלב שלוש פעמים נוספות. לאחר 30 הדקות האחרונות, הסירו את ריאגנט ה-spurs והוסיפו ריאגנט spurs טרי כדי לכסות את הבלוקים. השאירו את בלוקי ה-agri בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות.
החליפו את ריאגנט ה-spurs והסובבו למשך הלילה. למחרת בבוקר, החליפו שוב את ריאגנט ה-spurs והשאירו את המבחנות בסיבוב עד למחרת. בבוקר של היום הבא, העבירו את ריאגנט ה-spurs לתבניות סיליקון ממוספרות עד לכיסוי קל של תחתית התבניות.
כעת הניחו את בלוקי ה-agri לתוך התבניות והדגרירו בטמפרטורה של 60 °C למשך ארבע שעות. לאחר ארבע שעות, מלאו את התבניות עד הסוף בעוד ספורס (spurs) ובריאגנט, והדגרירו בטמפרטורה של 60 °C למשך הלילה. הוציאו את הבלוקים מהתבנית לצורך חיתוך (sectioning).
מוצגת כאן דוגמה למיקרוגרף של חיתוך דרך מרכזה של מושבה של שמרים מסוג Wild S Visia. שמרים אלה הם זן פרא שבודד מהפרשות של עצים. המושבה הודגרה במשך שישה ימים על מצע YNA לפני ביצוע החיתוך.
בתמונה זו, ניתן להבחין בקלות בין asai, pseudo hyphy ושמרים בצורה סביבית (ovoid), וגם האזור של המושבה הפולשת לאגר שמתחתיה נראה בבירור. חצים פתוחים מצביעים על asai מייצגים, חצים מלאים מצביעים על תאי צמיחה (vegetative cells) סביביים מייצגים, וראשי חצים מלאים מצביעים על שרשראות של תאים מוארכים ו-si. תמונה זו היא דוגמה למיקרוגרף אלקטרוני של חיתוך דק מזן מעבדה של שמרים SH 1 0 2 0 ו-W 3 0 3.רקע.
המושבה גודלה במשך שישה ימים במצע YNA לפני החתך. התמונה מראה אזור במושבה המכיל תדירות גבוהה של תאים עם נבגים. חץ מצביע על המבנה הדו-שכבתי של דופן הנבג.
בחלק A, אנו מציגים חתך של מושבה בת ארבעה ימים עם רשת המורכבת מ-15 מלבנים המוטבעת על התמונה בחלק B. תדירות התאים הקשורים לנבגים בכל מלבן מוצגת באמצעות 15 העמודות המתאימות ל-15 המלבנים המוצגים בחלק A. הנתונים הם הממוצע והטעות התקנית של ארבע מושבות עצמאיות בנות ארבעה ימים. בחלק C, מוצגים הממוצעים והטעויות התקניות עבור ארבע מושבות עצמאיות בנות שמונה ימים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשבועיים, הכוללים יום מלא אחד ומספר ימים של שעה עד שלוש שעות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להוסיף את התמיסות באופן מיידי כדי שהבלוקים לא יתייבשו בעקבות הליך זה.
שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית אימונו-היסטוכימית, עשויות לשמש לקביעת התפלגותן של תאים המבטאים חלבונים ספציפיים לאחר התפתחותם. טכניקה זו אפשרה לנו לבחון לא רק את דפוסי ההתבססות של תאים ספורולטיביים, אלא גם את דפוסי ההתבססות של תאי פסאודו-היפות במושבות croce CCI. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הטמיעה של מושבות שמרים לצורך חיתוך.
אל תשכחו כי רבים מהריאגנטים למיקרוסקופיה המשמשים בפרוטוקול זה עלולים להיות מסוכנים ביותר. אנא זכרו להשתמש במנדף, ללבוש ביגוד מגן ולהשליך את הריאגנטים באופן 적절. אוקיי, זה הכל.
תודה לצפייה. בהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לקיבוע בשיבוץ של מושבות שמרים, המאפשרת חיתוך לצורך מיקרוסקופיה של אור ואלקטרונים. הפרוטוקול מקל על ניתוח של תאים בספורולציה (sporulated) ותאים פסאודוהיפליים בתוך מושבות, ובכך תורם להבנת הארגון של סוגי תאים בקהילות פטריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה של פטריות
רקע
- מושבות שמרים מציגות סוגי תאים מגוונים.
- הבנת התפלגות התאים חיונית לחקר קהילות פטרייות.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא לספק תובבנות מפורטות לגבי ארגון התאים.
- שיטה זו מציעה גישה חדשה לוויזואליזציה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לקיבוע (embedding) של מושבות שמרים.
- מתן אפשרות לניתוח מפורט של התפלגות סוגי התאים.
- העמקת ההבנה של ארגון קהילת הפטריות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הסרת מושבות שמרים מלוחיות אגר.
- הטמעת מושבות באגר מותך.
- קיצוץ עודפי אגר להתאמה לתבניות.
- קיבוע, צביעה, דהידרציה וחדירה של שרף.
תוצאות עיקריות
- הטמעה מוצלחת של מושבות שמרים עבור מיקרוסקופיה.
- ויזואליזציה של תאי נבגים (sporulated cells) ותאים פסאודוהיפליים (pseudohyphal cells).
- ניתוח פירוט של התפלגות סוגי התאים בתוך המושבות.
- תובנות חדשות לגבי הארגון של קהילות פטריות.
מסקנות
- שיטת הסריקה יעילה עבור אנליזה במיקרוסקופיה.
- היא מספקת כלי בעל ערך לחקר מבנה מושבות שמרים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לחקור אינטראקציות פטרייתיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת הארגון המרחבי של סוגי תאים בתוך קהילות מיקרוביאליות תומכת בתיקוף מטרות בתהליכי גילוי של תרופות אנטימיקרוביאליות ואנטיפטרגיות. שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת הגטרוגניות פנוטיפית שעשויה להשפיע על התגובה לתרופה ועל התפתחות עמידות. היא מספקת ביטחון חיזואי לשלבים מוקדמים של סריקה על ידי קישור ארכיטקטורת המושבות לתתי-אוכלוסיות פונקציונליות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה של התפלגות תאים בספורולציה ובשלב הפסאודוהיפה בתוך מושבות.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על דפוסי סוגי התאים הקשורים למצבים פונקציונליים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לתהליכי עבודה המשכיים על ידי שימור מערכות היחסים המרחביות של סוגי תאים.
- ערך תפעולי: התייחסות לסטנדרטיזציה וליכולת שחזור של הבדיקה באמצעות חיתוך והדמיה עקביים של מבנים פנימיים של מושבות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: דן ברלוונטיות למחלה באמצעות הדמיה של אזורי מושבות פולשות המדמים חדירה מיקרוביאלית לרקמות המארח.
- ערך תפעולי: מתאר רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני על ידי אפשור מתאם מבני עם תוצאות פנוטיפיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
ממקמת את השיטה בשלב שבין הגילוי המוקדם לזיהוי תרכובות מובילות, בכך שהיא מאפשרת פנוטיפ מבני המנחה את ההחלטות בבדיקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור נתיבים באמצעות דימוי ישיר של התפלגות תאים אסימטרית.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה באמצעות הפקת חתכים עבים ודקים התואמים למיקרוסקופיה של אור ואלקטרונים.
- אנליטיקה: מדגיש פלטים כמותיים, כגון מיפוי תדירות של תאים עם ספורולציה באזורי מושבה שונים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית על ידי קישור חזיתות מושבה פולשניות למודלים של חדירה לרקמות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כבסיס רב-שימושי לניתוח מבני על פני זני פטריות ותנאים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזואי, תיקוף מטרה, והפחתת עמימות מכניסטית בהתנהגות של קהילות מיקרוביאליות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת התרחבות של הכנת מושבות עבור תהליכי עבודה של מיקרוסקופיה מרובי-משתמשים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התהליך (go/no-go), יעילות הון, והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות הפחתת סיכון פנוטיפית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף והחלטות קידום מותאמות סיכון, המבוססות על סממנים ביולוגיים מבניים של וירולנטיות או התמדה.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות מדעית בהיסטולוגיה, מיקרוסקופיה וטיפול במיקרואורגניזמים.
- דרישות לתשתיות מכשירים ואנליזה, הכוללות מיקרוטומים, מיקרוסקופי אור ואלקטרונים, ומערכות להסרגה בשרף.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולים של קיבוע, צביעה וחיתוך בין קבוצות מיקרוביולוגיה והדמיה.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, כגון חיידקים היוצרי ביופילם או מיני שמרים אחרים בעלי מורפולוגיית מושבות משתנה.
- מגבלות מעשיות הנתמכות על ידי חומר המקור, הכוללות מגבלות גודל מושבה (1-2 mm קוטר) וזמן עיבוד של מספר ימים הדורש טכניקה סטרילית למניעת זיהום.
