פרופיל ניסוי Bioenergetic באמצעות C2C12 תאים Myoblast

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את המצב התפקודי של מיטוכונדריה בתאים חיים ובמיטוכונדריה מבודדת, על ידי מדידה של פרמטרים מרובים של מטבוליזם חמצוני באמצעות ה-XF 96 extracellular flux analyzer. פרמטרים אלו הם נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים ונשימה מקסימלית או קיבולת נשימה רזרבית. דבר זה מושג על ידי הוספה רציפה של מודולטורים ספציפיים של נשימה מיטוכונדריאלית לתאי myoblast מסוג C2C12, ומדידת השינוי בשיעור צריכת החמצן, או OCR, המהווה אינדיקטור לנשימה, והמרת גלוקוז ללקטט, המייצרת ATP באמצעות גליקוליזה.

נתיב האנרגיה המרכזי השני בתאים נמדד גם הוא כ-ECAR או קצב החמצות חוץ-תאי. ניתן לקבל תוצאות של פרופיל מיטוכונדריאלי המספקות תובנה לגבי התפקיד המרכזי שפונקציית המיטוכונדריה ממלאת בקביעת תוחלת החיים של תאים. שלום, שמי דייוויד ניקולס.

הייתי חוקר של מיטוכונדריה לאורך כל הקריירה שלי, והציוד החשוב ביותר שבו השתמשתי במחקרי היה אלקטרודת החמצן. אם ניתן למדוד את קצב צריכת החמצן בתנאים שונים עם מיטוכונדריה מבודדת, מקבלים מידע רב וחשוב. כאשר עוברים לעבוד עם תאים, במיוחד תאים המגודלים בלוחית רב-בארים או על זכוכית כיסוי, השיטות הקלאסיות אינן יעילות.

זוהי בעיה מרכזית, שהופסקה לפני מספר שנים באמצעות פיתוח של בדיקת פלטות רב-בארים (multi-well plate assay), המאפשרת לנו לחקור את נשימת התאים במקביל בפורמט של פלטת רב-בארים. מה שתראו היום הוא ניסוי פשוט מאוד אך עשיר במידע, אותו תכננו כדי לנטר תפקוד ביו-אנרגטי מיטוכונדריאלי בסיסי בתאים בתרבית. כדי להתחיל, זרעו תאים בפלטות תרבית תאים XF 96 בריכוז של 10,000 תאים לבאר ב-100 µL של מצע גידול, והניחו באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2.

ניתן לבצע בדיקה של התאים ב-XF 96, 24 שעות לאחר הזריעה באמצעות הבדיקה. ה-Wizard יוצר תבנית עם פריסת הקבוצות הבאה. עמודות 1 עד 12 מכילות כולן 10,000 תאי C two C 12.

קבוצה אחת בכחול משמשת כתאי ביקורת. לקבוצה שנייה באדום יוענקו התרופות oligo Mycin, FCCP ו-roone. לאחר מכן, הכין את התרכובות בתווך בדיקה X-F-D-M-E-M כפי שמתואר בחלק הכתוב של הפרוטוקול.

Oligo Mycin, FCCP, rotenone ידועים. תרכובות אלו מחולקות מראש בערכת XF cell MIT stress test. באמצעות תחנת ההכנה XF prep station, החליפו את מצע הגידול במצע הרצה DMEM.

לבסוף, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ללא פחמן דו-חמצני למשך 60 דקות כדי לאפשר לתאים להגיע לשיווי משקל עם מדיום הבדיקה לפני הוספת התרכובות להזרקה למחסנית החיישן; חממו את התרכובות ל-37 °C. לאחר מכן, טענו אותן לפתחי המזרק באופן הבא: עבור עמודות אחת עד ארבע, טענו 16, 18 ו-20 µL של מדיום XF assay או DMEM לפתחים A, B ו-C בהתאמה.

עבור עמודות חמש עד 12, טען 16 µL של oligomycin לתוך יציאה A, 16 µL של FCCP לתוך יציאה B, ו-20 µL של rotenone לתוך יציאה C. לאחר מכן, הגדר את פקודות הפרוטוקול: קבע את הלולאה (loop) לשלוש פעמים, ערבוב (mix) לשלוש דקות ומדידה (measure) לשלוש דקות. לבסוף, לחץ על start.

עקבו אחר ההוראות על המסך, שינחו את המשתמש מתי להטעין את המחסנית עם סיום הכיול. פעל לפי הנחיות המשתמש והוסף את פלטת התאים עבור הניסוי. לאחר מכן לחץ על המשך ואפשר לבדיקה לרוץ.

הוצא את הפלטה כאשר הניסוי הסתיים. בדיקה זו נגזרת מהניסוי הקלאסי לאפיון תפקוד מיטוכונדריאלי ומשמשת כמסגרת לבניית ניסויים מורכבים יותר שמטרתם להבין השפעות של תרכובות שונות על חילוף החומרים בתא, על התפקוד המיטוכונדריאלי ועל פעילויות ביו-אנרגטיות כלליות. כאן צפינו לתגובה הצפויה בקצב צריכת החמצן בעוד התאים טופלו בכל רצף של תרכובות.

עבור ליגמיצין (oligomycin), רמת ה-ATP פחתה כתוצאה מחסימת סינתזת ATP בקומפלקס המיטוכונדרי החמישי. מכיוון שהתאים לא היו מסוגלים לסנתז ATP באמצעות חמצון פוספורילציה לאחר הטיפול בליגמיצין, הם חזרו להשתמש בגליקוליזה כדי לספק את דרישתם ל-ATP. לפיכך, הבחנו בעלייה ב-ECAR, קצב החמצצת החוץ-תאית, המהווה אינדיקטור לגליקוליזה כפי שהודגם בעבר. FCCP פועל כחומר מפקיע (uncoupling agent) ומסיר את המגבלה על כניסת הפרוטונים חזרה.

הנשימה מאיצה וכעת היא מוגבלת על ידי הובלת האלקטרונים. לבסוף, rotenone מעכב את קומפלקס 1 המיטוכונדריאלי, דבר הגורם להפסקת זרימת האלקטרונים בשרשרת הובלת האלקטרונים, ובכך צריכת החמצן הופחתה באופן דרמטי. בדרך זו מתקבל מידע על הנשימה הבסיסית של התאים, אחוז צריכת החמצן המוקדש לייצור ATP, וכן הכמות המוקדשת לשמירה על מפל הפרוטונים עקב דליפת פרוטונים.

יתרה מכך, אנו עשויים לקבל את קצב הנשימה המקסימלי בתנאים של נשימה לא מצומדת (uncoupled respiration), המכונה לעיתים קיבולת נשימה רזרבית (spare respiratory capacity). ולבסוף, אנו יכולים לקבוע את כמות צריכת החמצן שאינה נובעת מתהליכים מיטוכונדריאליים. ראיתם זאת כעת באמצעות ה-seahorse.

XF 96, סדרת ניסויים המספקת כמות עצומה של מידע על האנרגטיקה הביו-אנרגטית (BIE) של המיטוכונדריה בתא. הניסוי הבסיסי, שהוא כה חשוב, נקרא על ידינו ניסוי מספר אחת, והוא מספק מידע על נשימה בסיסית, מחזור ATP, דליפת פרוטונים מיטוכונדריאלית וקיבולת נשימה רזרבית. פרמטרים אלו מעניקים מידע בסיסי על המצב הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה בתא.