איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות את המודל הפיזיקלי הנכון המתאר את הקישור של מקרומולקולה לליגנד שלה, ולקבוע את הפרמטרים התרמודינמיים הנלווים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הכנת תמיסת מלאי של המקרומולקולה באמצעות דיאליזה נרחבת. לאחר מכן, הליגנד הרלוונטי מומס בבופר הדיאליזה הסופי, ובשלב השני נקבעים הריכוזים של כל הרכיבים.

מדגמי המקרומולקולה והליגנד מדוללים בזהירות לסדרה של ריכוזים שונים. לאחר מכן, מבוצעת סדרה של ניסויי קלורימטריה של טיטול תרמוסטטית (isothermal titration calorimetry), או ITC, בריכוזים שונים של הליגנד והחלבון, כדי להפיק סדרה של איזותרמות ITC בשלב הסופי של הפרוצדורה. ניתוח גלובלי של סדרת הניסויים מבוצע באמצעות מודלים פיזיקליים שונים, והמודל המעניק את ההתאמה הכללית הטובה ביותר מזוהה כנכון.

היום אציג בפניכם שיטה שיכולה לסייע במתן תשובות לשאלות ביופיזיות, כגון האופן שבו מולקולת חלבון נקשרת לליגנדים שלה, ויכולה לספק מדידות מדויקות של פרמטרי קישור כגון אנตรופיה, אנתלפיה וקבועי אסוציאציה. לפני תחילת הפרוטוקול, טהרו את החלבון הרלוונטי; המקרו-מולקולה המשמשת בהדגמה זו היא immuno GLYCOSIDE N six prime, a subtle transferase one I או a C six prime one I. כדי להתחיל, הכינו ארבעה ליטרים של בופר דיאליזה קררו ל-4 °C. לאחר מכן, בצעו דיאליזה לנפח קטן של תמיסת המקרו-מולקולה.

במקרה זה, חמישה מיליליטר של 400 micromolar AAC C six prime, one eye ב-1.3 ליטר של בופר דיאליזה בטמפרטורה של 4 °C. ניתן לבצע זאת בחדר קר או במקרר; יש להחליף לבופר רענן מדי שמונה שעות ולבצע דיאליזה של שלוש פעמים בסך הכל. שמרו את תמיסת הדיאליזה הסופית.

סננו 750 milliliters של תמיסת הדיאליזה הסופית דרך מסנן תאית של 0.45 micron ואחסנו בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius. באפר זה, אשר יכונה כעת באפר ההרצה, ישמש לשטיפות וכמדלל. עבור הדגימות, שטפו ביסודיות מסנן מזרק של 0.2 micron באמצעות באפר ההרצה.

יש להעביר את דגימת החלבון ולסנן. אספו בעדינות את הדגימה לשפופרת קונית לפני אחסון תמיסת החלבון, וקבעו את ריכוז החלבון באמצעות בדיקת חלבון סטנדרטית. במקרה זה, ריכוז החלבון נמדד על ידי ABSORBENCE ב-280 nanometers וריכוז האנזים מחושב.

תוך שימוש במקדם כיבוי שנוצר משרת הפרוטאומיקה EXI, אחסן את החלבון באופן שימקסם את היציבות לטווח ארוך. יש לאחסן את AAC C six prime one eye בטמפרטורה של 4 °C, כיוון שהוא אינו שומר על פעילותו לאחר הקפאה והפשרה. לאחר מכן, המס את הליגנד ואת תמיסת ההרצה. לצורך הדגמה זו, 4 mg של acetyl coenzyme A הומסו ב-200 µL של תמיסת הרצה כדי להכין תמיסת מלאי בריכוז 25 mM.

ניתן לאחסן ליגנד זה בטמפרטורה של 78- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש להכנת דגימות ה-ITC. ראשית, חשבו את ריכוז האנזים כדי לקבל ערך C של 64, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב עבור AAC 6'1. ערך זה מקביל לריכוז של 192 µM. הכינו תמיסה של 2 mL של המקרו-מולקולה בריכוז זה, על ידי דילול תמיסת המלאי בבופר הרצה מסונן של FIA settle co-enzyme a. הפשיתו את תמיסת ה-acetal coenzyme a באמבט קרח ומים. לאחר שהתמיסה הופשרה, ערבבו אותה בעדינות. חשבו את ריכוז תמיסת הליגנד על ידי הכפלת ריכוז המקרו-מולקולה במספר אתרי הקשירה וב-10.

הכינו את תמיסת ה-acetyl co-enzyme A על ידי הוספת 80 µL של תמיסת סטוק של 25 mM של ACE co-enzyme A ל-420 µL של running buffer וערבוב. העבירו את תמיסת ה-acetyl co-enzyme ACE המדוללת לשפופרת מילוי של פיפטה, והחזירו את שארית תמיסת הסטוק בריכוז 25 mM לטמפרטורה של 78-°C לאחסון. בצעו ניקוי גזים (degassing) לתמיסות ה-a C six prime one eye וה-a subtle co-enzyme A תחת ואקום למשך חמש דקות בטמפרטורה של 19°C, שהיא מעלה אחת פחות מטמפרטורת העבודה הרצויה בניסוי.

להכנת מזרק ההזרקה, הכניסו את המזרק דרך מחזיק מזרקים עד שסוג המזרקים המותקן מראש יהיה באותו גובה של המחזיק. העבירו את סוג המזרקים השני מעל מזרק ההזרקה עד שיילחץ בחוזקה אל תחתית מחזיק המזרקים. הדקו בעדינות את הסוג באמצעות מפתח אלן עם ראש כדורי במידה של 0.05 inch שסופק.

בשלב הבא, מקמו את מחזיק המזרק בתוך מחזיק הפיפטה. החליקו בעדינות את מחזיר הפיפטה לתוך מזרק ההזרקה וודאו שקצה הבוכנה מוזן ישירות לתוך חור המזרק. לאחר ההחדרה המלאה, הבריגו את טבעת הנעילה של מחזיק המזרק אל מחזיר הפיפטה.

לפני טעינת תמיסת הדגימה של חלבון A a C six prime one eye, השתמש במערכת שטיפת התאים המסופקת עם המכשיר כדי לשטוף את תא הדגימה בלפחות 50 milliliters של running buffer. הסר את שאריות הבאפר מתא הדגימה על ידי שאיבה באמצעות מזרק זכוכית של 2.5 milliliter עם מחט ארוכה. הסר את התמיסות מוואקום ניקוי הגזים (degassing vacuum) באמצעות מחט ארוכה שנייה, נקייה ויבשה.

מזרק של 2.5 מיליליטר. שאבו בזהירות נפח של לפחות 1.8 מיליליטר מדגימת החלבון A a C six prime one eye אל תוך המזרק. יש להקפיד למנוע היווצרות בועות אוויר.

לאחר טעינת מזרק עם דגימת החלבון, הכניסו את המחט לתא הדגימה וגעו בעדינות בתחתית התא. העלו את המחט בכ-1 מילימטר והזריקו בעדינות את הדגימה לתא עד שנוזל עודף ייראה מעל חלקו העליון של תא הדגימה. כדי לשטוף את התא מבועות אוויר כלואות, העלו את המחט בכ-1 סנטימטר תוך הבטחה שהתמיסה נשארת בחלק העודף, ולאחר מכן שאבו והזריקו במהירות כ-0.25 מיליליטר מהתמיסה.

כעת החליקו בעדינות את המחט כלפי מעלה לאורך דופן ה-overflow. בבאר הדגימה, המחט תפגוש מדף. שאבו את כל הנוזל שמעל מדף זה, כיוון שהמדף מציין את הגובה הרצוי עבור תמיסת ההרצה.

כדי למלא את מזרק ההזרקה, חברו את מזרק השאיבה עם צינור הפלסטיק אל פתח המילוי והורידו את קצה הבוכנה עד לראש פתח המילוי. כעת, הניחו את צינור מילוי הפיפטה של תמיסת הליגנד של DGAs בתחתית מחזיק הפיפטות. ודאו שקצה המזרק אינו נוגע בתחתית צינור המילוי, ושאבו באיטיות את התמיסה אל תוך המזרק עד שכמות קטנה תיכנס לצינור של מזרק הטעינה.

בשלב הבא, סגרו את פתח המילוי על ידי הורדת קצה הבוכנה. פעולה זו מבוצעת על ידי לחיצה על כפתור סגירת פתח המילוי. לאחר מכן, הסירו בועות אוויר שייתכן ונלכדו במהלך הטעינה.

בצעו ריקון ומילוי על ידי לחיצה על כפתור ה-purge refill. חזרו על פעולת הריקון והמילוי שלוש פעמים בסך הכל. עם השלמת תהליך הריקון והמילוי, הוציאו את צינור המילוי מתושבת הפיפטה ונגבו בעדינות את קצה המזרק בעזרת נייר ספיגה למעבדה.

כעת הורד את המזרק של מכלול הפ pipette אל תוך הדגימה. פעל בזהירות ובאיטיות, שכן המחט עלולה להתעקם בקלות. ודא שהמזרק מוכנס במלואו על ידי לחיצה על בסיס טבעת הנעילה.

לאחר קיבוע המזרק, הגדירו את טמפרטורת העבודה הרצויה ובחרו הספק ייחוס הגבוה מעט מזרימת החום המקסימלית הצפויה בעת ההזרקה. בדוגמה זו, נעשה שימוש ב-20 degrees Celsius וב-20 micro calories per second כטמפרטורת העבודה וכהספק הייחוס, בהתאמה. לאחר מכן, תכננו את נפחי ההזרקה ואת זמני ההמתנה הרצויים.

כאן נעשה שימוש ב-28 הזרקות, כאשר להזרקה הראשונה נפח של 2 µL והשהיה של 62, ולהזרקות הבאות נפח של 10 µL עם השהיות של 332. הניסוי המוצג כאן מספק את הבסיס ליצירת מערך נתונים בריכוז בודד לצורך הפקת העקומות הנוספות הדרושות. חזור על תהליך זה עם ריכוזי מקרו-מולקולה וליגנד פוחתים.

יש לוודא שכל דגימות המקרו-מולקולות והליגנדים מגיעות מאותו תמיסת סטוק כדי למזער שגיאות בריכוזים. מוצג כאן עקומת ה-isothermal titration calorimetry הגולמית שהופקה מהטיטראציה של 3.86 millimolar ליגנד acetyl coenzyme A לתוך 192 micromolar של המיקרו-מולקולה A A C six prime one.

ערכים משולבים של העין שימשו לקביעת פרמטרי הקשירה באמצעות התאמה רצפית לשני אתרים. גרף זה מציג את האיזותרמות שנוצרו באמצעות ITC של ריכוזים שונים של ACE Coenzyme A ו-AAC C six Prime One Eye. הנתונים הניסיוניים, המיוצגים על ידי עיגולים פתוחים, הותאמו הן למודל של שתי קבוצות אתרים בלתי תלויות והן למודל רצפי של שני אתרים.

התאמה טובה יותר נצפית במודל הדו-אתרי הרצפי. ריכוזי החלבון שנעשה בהם שימוש מוגדרים בטקסט הנלווה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לדייק מאוד בדילול, שכן שינוי בריכוזים עשוי להשפיע באופן דרסטי על התוצאות.