שיטות העברה מהירים לוקליזציה של פתוגנים מחלת ליים בתוך גוט טיק
14 בפברואר 2011
ליים מחלות מחקר מחקרים לעיתים קרובות דורשים דור של קרציות נגוע הפתוגן Borrelia burgdorferi, תהליך זה לוקח בדרך כלל מספר שבועות. כאן אנו מדגימים microinjection מבוססי זיהום סמן הליך זה יכול להתבצע תוך שעות ספורות. אנחנו גם להדגים שיטה immunofluorescence עבור בלוקליזציה באתרו של B. burgdorferi בתוך קרציות.
המטרה הכללית של הליך זה היא להזריק במיקרו-זריקה ולמקם תאי Borrelia bergii gertler בתוך מעי הקרציה. זאת מושג תחילה על ידי הכנת מחטי קפילריה מזכוכית ומילואן בתאי Borrelia bergii gertler. לאחר מכן, תאי Borrelia bergii gertler מועברים אל מעי הקרציה באמצעות מיקרו-זריקה.
לאחר מכן מבוצע ניתוח לקרציה ורקמות המעי מוסרות. לבסוף, מבוצע סימון אימונופלואורסצנטי של beberg defer במעי הקרציה. כתוצאה מכך, ניתן להשיג תוצאות המדגימות את הלוקליזציה של beberg to ferry במעי הקרציה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
שלום, אני ד"ר Ruth Paul Paul, מרצה בכירה במחלקה לרפואה וטרינרית באוניברסיטת מרילנד. היום שני מחברי המעבדה שלי, Toro Cairo, עמית פוסט-דוקטורט, ו-Adam Coleman, סטודנט לתארים מתקדמים, ידגימו לכם את הפרוצדורה להדבקה מלאכותית של קרציות באמצעות מיקרו-הזרקה, שאותה אנו מבצעים באופן שגרתי במעבדה. לאחר המיקרו-הזרקה, נבצע נתיחה של הקרצייה ונדמי את החיידקים במעי הקרצייה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (CE).
היתרון המרכזי של מיקרו-הזרקה לקרציים על פני הדבקה טבעית של דור קרציים הוא משך הפרוצדורה. המיקרו-הזרקה מקצרת את התהליך כולו משבועות לשעות, שכן להפקת קרציים נגועים באמצעות תהליך הזנה טבעי נדרשים כחמישה שבועות. ניתן להתאים טכניקה זו גם להזרקת ריאגנטים שימושיים אחרים, כגון RNA דו-גדילי עבור RNAi או אנטי-סרומים להפרעה של נוגדנים ספציפיים בתוך הקרצייה.
כדי להתחיל, הכינו מספר מחטי מיקרו-הזרקה על ידי חימום ומתיחה של צינורות קפילריים מזכוכית בקוטר של מילימטר אחד במכשיר למתיחת מיקרו-פיפטות מזכוכית. הוציאו בזהירות את הצינורות הקפילריים השבירים. אחסנו את המחטים המרוכזות כאשר הקצה פונה כלפי מעלה על סרט דביק בתוך צלחת פטרי.
בשלב הבא, גדלו b berg de ferry בתרבית BSK. כשהריכוז במצע הוא כ-10⁷ תאים למיליליטר, השקיעו את b berg de ferry על ידי סנטריפוגציה ב-3000 ×g למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, הסירו את העלייה והחזירו את המשקע לתליה מלאה במצע BSK על ידי העברה עדינה דרך מיקרו-טיפ סטרילי של 200 µL, עד לריכוז סופי של 10⁹ תאים למיליליטר.
מכיוון שהתאים מושבים מחדש בצפיפות תאים גבוהה ועלולים להיווצר גושים, יש להשתמש בתרחיף התאים באופן מיידי להזרקה מיקרוסקופית. להכנת הקרציות, הנח סרט דביק דו-צדדי שקוף על תיתערת זכוכית תוך עבודה על משטח דביק, והסר בזהירות את הקרציות מהמיכל. באמצעות מברשת קטנה, הנח את מספר הקרציות הדרוש להזרקה על הסרט הדביק, כאשר הצד הבטני פונה כלפי מעלה ובכולן אותו כיוון. טען 5 µL של תרבית beberg de ferry למחט קפילרית מאוחדת. באמצעות טיפ של פיפט לטעינה מיקרוסקופית של 20 µL, בדוק אם נלכדו בועות אוויר במחט וטען אותה שוב בתרבית החיידקים.
במידת הצורך, התבוננו בקרצית תחת מיקרוסקופ סטריאומסקומי והתמקדו באזור פתח פיחר הקרצית. געו בעדינות בקצה מחט הקפילרה כדי לשבור את הצינור בנקודה שבה הקוטר קטן מעט מקוטרו של פתח פיחר הקרצית, ובכך צרו את מחט המיקרו-הזרקה. שלב זה הוא קריטי, שכן כל ניסיון להזריק לקרציות באמצעות קצוות מחט שאינם מתאימים גורם לפגיעה וייתכן שיוביל למוותן.
בקרב הקרציה שהוזרקה. הניחו את הקרציות המקובעות תחת מיקרוסקופ בינוקולרי לדיסקציה ומקדו את המבט על פתח האניס, המכוסה על ידי שתי פלטות אנליות ניידות. בעזרת פינצטה עדינה, געו בעדינות והפעילו לחץ קל מאוד בכל אזור סביב פתח האניס.
פעולה זו תאפשר את הפרדת הלוחיות האנאליות ופתיחה של הנקב האנאלי המתחבר למעי. הכניסו בזהירות את קצה המחט מעט לתוך הפתח האנאלי דרך הפתיחה המאולצת של הלוחיות האנאליות. יש לצמצם ככל האפשר את החדרת המחט, שכן קצה הזכוכית עלול לפגוע במעי האחורי השקוף למחצה המתחבר לרקטום.
באמצעות מיקרו-מזרק המצויד בבקרת רגל אוטומטית, מזריקים תמיסת beberg de ferry לפי הפרמטרים הבאים: לחץ הזרקה של 1000 Hector Pascals, זמן הזרקה של 0.2 seconds, ולחץ פיצוי של eight Hector Pascal's. כל tick מקבל הזרקה בודדת לאחר ביצוע המיקרו-הזרקה.
הקרצייה צריכה להפגין סימני תנועה או לזחול בתגובה לגירויים בדומה למצב לפני ההזרקה. לצורך דיסקציה של קרציות עבור מיקרוסקופיה של אימונופלורסנציה, יש להניח תחילה טיפה של Phosphate Buffered Saline על שקופית זכוכית נקייה לדיסקציה, וטיפה נוספת על שקופית מצופה Poly L Lysine. לצורך המיקרוסקופיה, הכינו שקופית זכוכית נוספת עם סרט דבק דו-צדדי. לאחר מכן, הוציאו את הקרצייה מהמכל והניחו אותה על סרט הדבק הדו-צדדי.
באמצעות מברשת קטנה תחת מיקרוסקופ ההפרידה, התמקדו בקרצייה והניחו להב תער חדה על הקרצייה בין זוג הרגליים הראשון לשני. לחצו בחוזקה כדי לחתוך את הקרצייה לשני חלקים, ובכך לחשוף את הבטן; מיד לאחר מכן, טבלו את הבטן בטיפת PBS בעזרת פינצטה עדינה. אחזו בשלד החיצוני הגבי והבטני מסביב לאתר החיתוך.
משכו בזהירות את המגן הגבי (dorsal shield) למעלה והרחיקו אותו מהקרציה כדי לחשוף את שלוחות המעי בעלות הגוון החום. הקפידו להשאיר את הקרציות המנותחות תחת PBS בכל עת. צרורות בלוטות הרוק השקופות למחצה ממוקמות משני צידי האזור הקדמי של המעי וניתן להסירו בשלב זה אם ברצונכם.
תוך כדי החזקת שארית השלד החיצוני במקומו באמצעות פינצטה, משוך בזהירות את המעי החוצה מהבטן. נקה בזהירות את המעי על ידי הסרת רקמות כלואות, כגון הטרכיאה. באמצעות קצה של פינצטה עדינה, העבר במהירות את מעי הקרציה לתוך טיפת PBS על תבנית זכוכית מצופה poly L lysine.
חלקו את המעי לחלקים קטנים יותר באמצעות להבים דקים או על ידי לחיצה עדינה עם קצה של פינצטה דקה. שאבו בזהירות את עודפי ה-PBS שסביב רקמות המעי. הניחו לרקמות המעי להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר.
קבעו את מעי הקרציה על ידי טבילה באצטון למשך 10 דקות. הניחו לו להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר; ניתן לאחסן את השקופיות בשלב זה למשך חודשים בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס בתוך מיכל אטום. לצורך סימון אימונופלואורסצנטי של המעי, שרטטו עיגול סביב מעי הקרציה הקבוע באמצעות עט PAP או מכשיר אחר ליצירת מחסום הידרופובי.
פעולה זו תסייע בשימור תמיסאות הצביעה במהלך שלבי הדגירה הבאים. כסו את מעי הקרציה בטיפה אחת או בכמה טיפות של תמיסת חסימה (blocking buffer) למשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר.
הסרום המשמש לחסימה תלוי במקור בעל המארח של הנוגדן. אין לאפשר לסלייד להתייבש מהשלב הזה ואילך. שאבו באיטיות את תמיסת החסימה.
דגרו את המעי עם תמיסות נוגדנים ראשוניים ו/או משניים מתאימים. אנו משתמשים בנוגדן anti B berg המסומן בفلואורסצאין, איזוטיוציאנאט, או FXI. הגבישו את הנוגדן בדילול של 1:100 בתמיסת חסימה למשך שעה אחת.
בטמפרטורת החדר, כסו את המכל ברדיד אלומיניום כדי להגביל את החשיפה לאור. הסירו את תמיסת הנוגדנים באמצעות שאיבה עדינה. דגרו את המעי עם צבע פלואורסצנטי לסיומני רקמות קרציות, כגון DPI או propidium iodide.
בדרך כלל אנו משתמשים ב-20 µg/mL של peridium iodide ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שוטפים שלוש פעמים עם 0.05% tween 20 ב-PBS למשך חמש דקות. לבסוף, מקבעים את הפלטה בגליצרין בבפר (buffered glycerol) המכיל רכיב Antifa ומכסים בזהירות בכיסוי זכוכית. ניתן לאחסן את הפלטות בשלב זה למשך מספר חודשים ב-4 °C במיכל אטום לאוויר, ולבצע דימוי ואיתור של b berg de ferry תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי.
כאן מוצגת מיקרו-הזרקה לקרדית, כאשר המחט מלאה בצבע kumasi brilliant blue לצורך נראות. נעשה שימוש בפינצטה עדינה להפעלת לחץ קל על הגוף, מה שמאפשר את הפרדת הלוחיות האנאליות ופתיחה של הנקב האנאלי לצורך המיקרו-הזרקה. כאן מוצג האזור הקדמי של שקיק מעי (diverticulum), כאשר beberg ferry נמצא בתוך המעי.
גרעיני המעי והספירוכטות מסומנים באמצעות propidium iodide או נוגדן anti beberg ferry המשולב עם fitzy, בהתאמה. לאחר שליטה בטכניקה, מצאנו שניתן לבצע מיקרו-הזרקה ל-10 קרציות עם מאה אלף צaאיים שרדו ומודבקים ב-fer. למרות שניתן להשתמש בקרציות מיד לניסויים אחרים, אנו ממתינים בדרך כלל יום או יומיים כדי לוודא שהקרציות שורדות את ההליך לפני ההמשך.
לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן יצירת קרציות מזוהמות באופן מלאכותי באמצעות הזרקה מיקרוסקופית ומחסום מקומי בתוך מעי הקרציה, תוך שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית ואימונופלואורסצנציה. עבודה עם קרציות ומחטים דקות מזכוכית המלאות בפתוגן אנושי כגון Borrelia burgdorferi עלולה להיות מסוכנת בזמן העבודה. היו מודעים למיקומן של הקרציות והמחטים והקפידו על נהלי בטיחות ביולוגית ברמה 2 (BSL-2) בכל עת.
תודה לצפייתכם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה המבוססת על מיקרו-הזרקה להדבקת קרציות ב-Borrelia burgdorferi, המקצרת באופן משמעותי את הזמן הנדרש להדבקת הקרצייה. בנוסף, מוצגת טכניקה של אימונופלואורסצנציה לאיתור מיקום הפתוגן בתוך רקמות הקרצייה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- ביולוגיה של וקטורים
- מיקום פתוגנים
רקע
- מחלת הליימ (Lyme disease) נגרמת על ידי החיידק Borrelia burgdorferi.
- קרציות הן הווקטורים העיקריים להעברת פתוגן זה.
- שיטות מסורתיות להדבקת קרציות הן גוזלות זמן.
- שיטות הדבקה מהירות יכולות להגביר את יעילות המחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהירה יותר להדבקת קרציות ב-B. burgdorferi.
- מתן אפשרות לאיתור in situ של הפתוגן ברקמות הקרצייה.
- שיפור ההבנה של האינטראקציות בין הקרצייה לפתוגן.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת מחטי קפילריה מזכוכית למיקרו-הזרקה.
- מיקרו-הזרקה של תאי B. burgdorferi למעי הקרצייה.
- ניתוח קרציות לבידוד רקמות המעי.
- סימון אימונופלואורסצנטי של B. burgdorferi ברקמות המעי.
תוצאות עיקריות
- מיקרו-הזרקה מוצלחת של B. burgdorferi למעיי הקרצייה.
- הדגמה של לוקליזציה יעילה של הפתוגן באמצעות אימונופלורסנציה.
- ויזואליזציה של התוצאות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- השיטה מקצרת משמעותית את זמן הדבקת הקרצייה.
מסקנות
- טכניקת המיקרו-הזרקה מהווה חלופה יעילה להדבקת קרציות.
- אימונופלואורסצנציה מאפשרת מיקום מדויק של פתוגנים.
- גישה זו עשויה להקל על מחקרים נוספים בנושא העברת מחלת הלייים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הדבקה מהירה ומבוקרת של קרציות וקטוריות ב-Borrelia burgdorferi מאפשרת מחקר יעיל של אינטראקציות בין הפתוגן לווקטור, החיוניות למחקר על מחלת הלייים. גישת מיקרו-הזרקה זו מקצרת את לוחות הזמנים של ההדבקה משבועות לשעות, ובכך תומכת בסריקה בתושבה גבוהה (high-throughput screening) ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבים מוקדמים של הגילוי. השיטה מספקת החדרה שמישה של הפתוגן, ובכך מגבירה את הביטחון הניבוי במסלולי תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של האינטראקציות בין Borrelia burgdorferi למעי הקרציה כדי לתקף מטרות טיפוליות המעורבות בהישרדות ובמעבר של הפתוגן.
- ערך תפעולי: מספק עומסי פתוגנים סטנדרטיים בין קבוצות קרציות, ובכך מפחית את השונות במודלים של זיהום ומשפר את השחזור של הבדיקה.
- ערך ניבוי: תומך בהפחתת סיכונים (de-risking) של מטרות תפקודיות על ידי מתן אפשרות לחשיפה מבוקרת לזני פתוגן, כולל זנים שהוחלשו במודלים עכבריים.
סריקה ופיתוח מבחנים
- ערך מדעי: יצירת רקמות של קרציות נגועות המתאימות לבדיקות אימונופלואורסצנציה ודימות קונפוקאלי להערכה כמותית של מיקום ועומס הפתוגן.
- ערך תפעולי: הפקת תוצרים כמותיים ומוכנים למיקרוסקופיה, המאפשרים סטנדרטיזציה של קריאות לגילוי פתוגנים לאורך קמפייני סריקה.
- יכולת הרחבה: מקל על הכנת מספר רב של קרציות נגועות באופן אחיד, דבר התומך בחזרתיות של הבדיקה ובשימוש חוזר בפלטפורמה במערכות סריקה מבוססות וקטורים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך חקר מיקומו של *Borrelia burgdorferi* במעי הקרצייה, ומגשר בין ממצאים in vitro לבין פתופיזיולוגיה מבוססת וקטור.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשר ויזואליזציה של פיזור הפתוגן בתוך רקמות הקרצייה, ובכך מסייע בניסוח השערות לגבי גורמי וירולנציה ספציפיים לרקמה ומנגנוני הדבקה.
- דיוק של מודלים פרה-קליניים: תומך בהחלטות קידום מותאמות-סיכון על ידי אספקת חשיפה עקבית לפתוגן לצורך הערכת יעילות של התערבויות במודלים של מחלות המועברות על ידי קרציות.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו נטמעת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית, על ידי אפשור ייצור מהיר של קרציות וקטוריות נגועות ומדדים סטנדרטיים לאיתור הנתיב של הפתוגן.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של אינטראקציות בין פתוגן לווקטור על ידי הובלת כמויות מבוקרות של Borrelia burgdorferi למעי הקרצייה לצורך חקירה מכניסטית.
- סריקה: מייצרת רקמות קרצייה מזוהמות סטנדרטיות המתאימות לבדיקות אימונופלואורסצנציה כמותיות, ובכך משפרת את השחזוריות בתהליכי זיהוי פתוגנים.
- אנליטיקה: מייצרת תוצאות המבוססות על מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקום ועומס הפתוגן, מה שמאפשר ניתוח השוואתי בין תנאים התנסייתיים והתערבויות שונות.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תרביות פתוגנים in vitro למיקום ברקמות הקרצייה, ובכך תומכת בהתאמת סמנים ביולוגיים (biomarkers) וברלוונטיות פתופיזיולוגית במודלים של מחלות המועברות על ידי וקטורים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר להדבקת קרציות בסוכנים ביולוגיים מגוונים, כולל נוגדנים וריאגנטים של RNAi, ובכך מרחיבה את התועלת מעבר למחקרי Borrelia burgdorferi.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין הפתוגן לווקטור באמצעות זיהוי מקומי של הפתוגן.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסקילביליות של מודלים להדבקת קרציות, ובכך מפחית את השקעת הזמן והמשאבים בהשוואה לשיטות הזנה טבעיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות קבלת החלטות ה-go/no-go בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי אספקת מודלים מהירים וסטנדרטיים של חשיפה לפתוגן לצורך הפחתת סיכונים במטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של יוזמות מחקר למחלת הלייים באמצעות מודלים אמינים ובנאמנות גבוהה להדבקה, המפחיתים את השונות הביולוגית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של מיקרו-הזרקה, טיפול בקרציות ומיקרוסקופיה של אימונופלוורסצנציה קונפוקלית.
- תלוי בהכנת מחטי קפילריה מזכוכית, במכשור מיקרו-הזרקה ובתשתית של מיקרוסקופיה פלוורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרמטרי ההזרקה ושל פרוטוקולי נתיחה של המעי בין הצוותים, כדי להבטיח העברה עקבית של הפתוגן ותוצאות מיקום מדויקות.
- התאמה למינים שונים של קרציות או לזנים שונים של פתוגנים עשויה לדרוש אופטימיזציה של גודל המחט, לחץ ההזרקה וריכוז החיידקים.
- מגבלות מעשיות כוללות את המיומנות הטכנית הנדרשת למיקרו-הזרקה ונתיחת מעי מוצלחות, כמו גם את הצורך בהכלה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בעת טיפול בפתוגנים אנושיים.
