פוליאתילן גליקול יעיל (PEG) מתווכת טרנספורמציה של מוס Physcomitrella patens
19 באפריל 2011
שיטה פשוטה ויעילה להפוך Physcomitrella pantens Protoplasts מתואר. שיטה זו מותאמת פרוטוקולים Physocmitrella Protonemal protoplast ו ארבידופסיס Protoplast mesophyll שינוי 1.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע טרנספורמציה של פרוטופלסטים של SCO Metre. הדבר מושג תחילה על ידי עיכול הצמחים באמצעות Drizly. לאחר מכן, הפרוטופלסטים נשטפים עם mannitol כדי להסיר את ה-drizly, ואז מדגירים אותם עם DNA ו-peg.
לבסוף, הפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה נפרסים על צלחות ועוברים אינקובציה. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה ומבטאים חלבונים המסומנים פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. את הפרוצדורה תדגים Y lu, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי.
היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא יעילה ומייצרת בעקביות פרוטופלסטים המבטאים את החלבון המבוקש. כדי לבודד פרוטופלסטים של אזוב, התחילו בהוספת תשעה מיליליטרים של 8% mannitol לפיתרי, באמצעות שפתולה. העבירו אזוב בן חמישה עד שבעה ימים משתי עד שלוש צלחות PP NH 4 אל תוך ה-mannitol. אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף עבור שלב זה ועבור מתכוני ריאגנטים נוספים. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של 2% drizly והדגרימו בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין למשך שעה אחת.
סננו את התערובת דרך רשת של 100 micron כדי לקבל סספנסיה ירוקה הומוגנית. לאחר מכן, סובבו את התסנן במהירות של 250 G למשך חמש דקות. השליכו את הנוזל העילי בזהירות רבה.
שחזר את הפרוטופלסטים ב-500 microliters של 8%mannitol. לאחר מכן, הוסף 9.5 milliliters נוספים של 8%mannitol. ודא שהפרוטופלסטים תלוים באופן מלא בתמיסה.
בצעו את שלבי השטיפה פעמיים נוספות על ידי סבב צנטריפוגה נוסף של התמיסה ב-250 G למשך חמש דקות. השליכו את העלייה (supernatant) והשביו את הפרוטופלסטים. ראשית ב-500 microliters.
לאחר מכן, יש להוסיף 9.5 milliliters של 8% mannitol ולהשתמש ב-hemo cytometer. ספרו את מספר הפרוטופלסטים ב-10 microliters של התרחוף כדי להעביר DNA אל הפרוטופלסטים המבודדים. ראשית, סובבו את תערובת הפרוטופלסטים ב-250 G למשך חמש דקות.
הסיר את הנוזל העליון וסספנד מחדש את הפרוטופלסטים בריכוז של 1.6 מיליון למילילטר בתמיסת MMG. הדגר את התמיה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של תמיסת הפרוטופלסטים למבחנה המכילה 60 מיקרוגרם של DNA. נער.
הוסיפו בעדינות 700 µL של תמיסת PEG סידן ונערבבו. דגרו היטב את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות במהלך תקופת המתנה זו. כסו את פלטות ה-PRMB בניילון נצמד.
לאחר מכן, יש לדלל את התרחיף עם שלושה מיליליטרים של תמיסת W five ולסובב ב-250 G למשך חמש דקות. כדי להסיר את ה-PEG, יש לערבב מחדש את הפרוטופלסטים בשני מיליליטרים של PRMT ולהעביר מילליטר אחד לכל לוח PRMB המכוסה בסלופן. יש לשמור את הלוחות בטמפרטורה של 25 °C בתא גידול.
לבסוף, ארבעה ימים לאחר הטרנספורמציה, העבירו את הסלופן לצלחות ברירה טריות. דמות זו מראה דוגמה לצמחים בני 18 ימים שחוּדשו מפרוטופלסטים, אשר עברו טרנספורמציה עם 15 micrograms של DNA פלסמיד super coiled, הנושא קסטה לעמידות להיגרומיצין. כאן, 30 micrograms של אותו DNA פלסמיד super coiled הועברו בטרנספורמציה לפרוטופלסטים.
60 מיקרוגרם של DNA פלייד הוכנסו בטרנספורמציה למדגם זה. ולבסוף, צמחים אלו שוחזרו מפרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה עם 120 מיקרוגרם של אותו DNA פלסמידי סופר-סלילי הנושא את קסטת העמידות להיגרומיצין. יעילות הטרנספורמציה אינה מושפעת מריכוזי DNA של עד 60 מיקרוגרם.
עם זאת, ריכוזים גבוהים יותר של DNA פוגעים בהליך זה. הנתונים מעידים כי שיטה זו מספקת תוצאות עקביות על פני טווח רחב של כמויות DNA בכל סמסטר. ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש שעות אם היא מבוצעת כהלכה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון RNAi זמני ושביטת גנים (gene knockouts) על מנת לענות על שאלות נוספות בנוגע לתפקוד הגנים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens. הטכניקה מותאמת מפרוטוקולים קיימים לטרנספורמציה של פרוטופלסטים ומטרתה להניב תוצאות עקביות ומוצלחות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של צמחים
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה של התא
רקע
- פרוטופלסטים הם תאי צמח שדפנות התאים שלהם הוסרו.
- טכניקות טרנספורמציה הן חיוניות לחקר תפקוד גנים בצמחים.
- Physcomitrella patens משמש כאורגניזם מודל במחקר צמחים.
- שיטות קיימות לטרנספורמציה של פרוטופלסטים עלולות להיות מורכבות וגוזלות זמן.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול יעיל לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens.
- לשפר את היעילות והמהימנות של טרנספורמציית פרוטופלסטים.
- להקל על מחקרים גנטיים נוספים בטחב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- עיכול רקמת טחב באמצעות Drizly לבידוד פרוטופלסטים.
- שטיפת פרוטופלסטים במניטול להסרת מזהמים.
- טרנספורמציה של פרוטופלסטים מבודדים באמצעות DNA בעזרת PEG.
- דגירה של פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה על מצע ברירה.
תוצאות עיקריות
- פרוטופלסטים שעברו טרנספורמציה ביטאו בהצלחה חלבונים פלורסצנטיים.
- השיטה הראתה יעילות טרנספורמציה עקבית בריכוזי DNA שונים.
- נמצא כי ריכוזי DNA גבוהים יותר פוגעים בהצלחת הטרנספורמציה.
- ניתן להשלים את הפרוצדורה כולה תוך כשלוש שעות.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה מהימנה לטרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens.
- היא מאפשרת ביצוע ניסויים עוקבים כגון RNAi זמני ושבירת גנים (gene knockouts).
- הפרוטוקול עשוי לסייע משמעותית בהבנת תפקוד גנים בטחב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנספורמציה של פרוטופלסטים של Physcomitrella patens בתיווך PEG מאפשרת העברה יעילה וניתנת לשחזור של גנים, ובכך תומכת בגנומיקה תפקודית בעלת תפוקה גבוהה במערכות צמחים. יכולת זו היא קריטית עבור צוותי גילוי מוקדם המבקשים לבחון תפקוד גנים, לתקף מטרות ולהאיץ את פיתוח הבנת המסלולים הביולוגיים במודל הניתן לטיפול גנטי. הפוטנציאל של השיטה לשבירה (scalability) ולסטנדרטיזציה הופך אותה לבעלת ערך לסריקה גנטית של פוביליאו של תרכובות ולהפחתת סיכונים מכניסטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של תפקוד גנים באמצעות הולכה יעילה של DNA לתאי טחב.
- תומך בת targeting של גנים בתדירות גבוהה לצורך תיקוף תפקודי של מטרות וניתוח מסלולים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות לביצוע שינויים גנטיים מדויקים במערכת מודל.
- משפר את רמת הביטחון החזויה עבור היפותזות ביולוגיות המשך.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פרוטוקול סטנדרטי ליצירת מספר רב של טרנספורמנטים עבור בדיקות סריקה.
- מספק יעילות טרנספורמציה הניתנת לשחזור, התומכת באמינות ובשקיפות (scalability) של הבדיקה.
- מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מועמדות להערכת תרכובות וסריקה פנוטיפית.
- מפחית את התלות בציוד מיוחד, ובכך מגביר את הנגישות עבור צוותים הפיתוח של הבדיקות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מאפשר יישומים המשכיים כגון RNAi זמני ומחקרי knockout של גנים הרלוונטיים למודלים של מחלות.
- תומך ברצף מהגיית גנים ועד לאישור פרה-קליני במערכות מבוססות צמחים.
- מספק פלטפורמה לחקירת ביומרקרים תרגומיים כאשר היא מותאמת למסלולים הרלוונטיים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
פרוטוקול טרנספורמציה זה משתלב ברצף השלבים שבין הגילוי המוקדם לזיהוי מובילים, ומאפשר מניפולציה גנטית, תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות במודלים של צמחים.
- ביולוגיה של גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים באמצעות הובלה יעילה של גנים וניתוח ביטוי.
- סריקה: תומכת במוכנות ובשחזור של בדיקות על ידי יצירת אוכלוסיות טרנספורמנטים עקביות.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים, כגון יעילות טרנספורמציה וביטוי חלבון, לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציוני: מאפשרת מחקרים גנטיים המנחים פיתוח מודלים פרה-קליניים וזיהוי סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת טרנספורמציה סטנדרטית ורב-שימוש עבור מחקרים גנטיים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תפקוד גנים.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת התרחבות (scalability) עבור תהליכי עבודה של טרנספורמציה גנטית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפקה חסונה של נתונים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מטרות ומסלולים גנטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאי צמחים ובטכניקות סטריליות עבור בידוד והטרנספורמציה של פרוטופלסטים.
- נדרשת גישה לתשתית מעבדה בסיסית, כולל סנטריפוגציה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית לצורך תיקוף התוצאות.
- נדרש סטנדרטיזציה של פרמטרי ההטרנספורמציה בין צוותים שונים להבטחת הדירות הפרויקטים.
- ייתכן שיידרש התאם לשימוש במינים של צמחים או במערכות מודל אחרות מעבר ל-Physcomitrella patens.
- יעילות ההטרנספורמציה רגישה לריכוז ה-DNA, כאשר כמויות גבוהות יותר עלולות להזיק.
