חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג את המבנה התלת-ממדי של קומפלקס האקסוזום באמצעות שיטת הנטייה הקונית האקראית (random conical tilt). מטרה זו מושגת תחילה על ידי השקעת שכבה דקה של קריל פחמן על גבי רשת פחמן מחוררת (holy carbon grid) כדי ליצור את תשתית התמיכה עבור קומפלקס החלבון, ובשלב שני באמצעות צביעה. הדגימה והצבע מוחלים על הרשת, תהליך הקוברת את הדגימה בתוך מלחים של מתכות כבדות.

לאחר מכן מבוצעת מיקרוסקופיה אלקטרונית כדי לקבל זוגות של מיקרוגרפים של הדגימה בזוויות הטיה שונות. לבסוף, מתקבלים תוצאות המראות את המבנה התלת-ממדי של קומפלקס האקסוזום, בהתבסס על ניתוח תמונה באמצעות שיטת ההטיה הקונית האקראית (random conical tilt method). באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה זו עשויים להתקשות, כיוון שלעיתים הכנת הדגימה עבור שיטת ההטיה הקונית האקראית היא מאתגרת, וכן끔 הליך עיבוד התמונה העוקב לאחר מכן.

הדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי דירוג והכנת הדגימה קשה ללמוד ללא המחשה של הערכת הדגימה. העקרון של שיטת ההטיה הקונוסית האקראית דורש צילום של זוג מיקרוגרפים של אותו אזור בדגימה בתוך מיקרוסקופ האלקטרונים. תמונה אחת מצולמת כאשר הדגימה במצב ללא הטיה, והתמונה השנייה מצולמת כאשר הדגימה מוטה בזווית שבין 50 ל-70 מעלות. באמצעות המחשב, זוג המיקרוגרפים המודגיתים מוצב זה לצד זה, ובהמחשה זו נבחרים תמונות מאותם חלקיקים.

תמונות אלו מסומנות במספרים בקואורדינטות תלת-ממדיות. התמונות של חלקיקים ללא הטיה ובני זוגם שהוטו מקושרות זו לזו באמצעות כיוון ציר ההטיה וזווית ההטיה. יישור תמונות החלקיקים ללא ההטיה מביא את התמונות של החלקיקים שהוטו למיקומים המתאימים להם ב-asMule; באמצעות שימוש במספר תמונות של חלקיקים שהוטו הממלאות את המרחב האזימותי, ניתן לשחזר את המבנה התלת-ממדי של המולקולה באמצעות אלגוריתם של היטל אחורי (back projection). כדי להכין את הרשתות תחילה, הכינו תמיסת 0.5% form VAR על ידי הוספת 0.45 גרם שרף poly vinyl formal ו-90 מיליליטר של כלורופורם לכלי ביקר זכוכית בנפח 100 מיליליטר.

בתוך תא מ hút, כסו את הכוס בכסף אלומיניום והמיסו את שרף ה-form var. בעזרת שרף ערבוב מגנטי קטן ומערבל מגנטי, ייקח לשרף כ-15 דקות להתמוסס. בינתיים, נקו שקופיות זכוכית למיקרוסקופיה שננקו מראש באמצעות מתנול וניקיון עם ניירות Kim wipes.

לאחר שהשרף form var נמס לחלוטין בתוך הכלורופורמה, הוסיפו מיליליטר אחד של 50% glycerol לפני השטח של התמיסה. התאמת נפח ה-glycerol המוסף משפיעה על צפיפות החורים בתוך ה-holy carbon.

הטמיעו את קצה המהודה של המכשיר האולטרסוני לתוך התמיסה. בעומק של כאינץ' אחד, השתמשו בהספק מרבי לביצוע סוניקציה למשך דקה אחת, מה שייצור אמולסיה של טיפות גליצרול בתוך התמיסה שלנו. סוניקציה ממושכת יותר תגרום ליצירת חורים קטנים יותר בפחמן הנקבוב.

התמיסה הופכת חלבית לאחר שלב זה. מיד לאחר הטבילה באולטרהסוניקציה, הכניסו את השקופיות הזכוכית הנקיות אנכית אל תוך האמולסיה. לאחר שנייה אחת, הוציאו אותן ונגבו את חלקן התחתון של השקופיות בעזרת נייר סינון כדי ליצור שכבת פלסטיק דקה על פני השטח של השקופיות.

לאחר התאיידות הכלורופורם, בדקו את צפיפות וגודל החורים בסרט תחת מיקרוסקופ אור. תנאי ההכנה המתוארים כאן אמורים להניב בין 10 ל-20 חורים בכל ריבוע של רשת 400 mesh, עם קטרים שבין שלושה לארבעה מיקרומטרים. ברגע ששקופיות הזכוכית יתייבשו, גזרו את קצה סרט הפלסטיק על פני השטח של השקופית.

הצמיפו את השכבה על פני מים מזוקקים על ידי טבילה אנכית של העגלה במים. ניתן להבחין בשכבה הדקה על פני המים בזווית שכיבה אל מול השתקפות האור. הניחו רשתות נחושת בעובי 400 mesh על השכבה, אחת אחת, כאשר הצד החלק של הרשת פונה כלפי מטה.

הרימו את רדיד הפלסטיק עם הסריג באמצעות פיסת נייר. הפכו את הנייר והניחו לו להתייבש. בתוך צלחת פטרי, השרו את הנייר במתנול כדי להסיר את הגליצרול השאריתי מהחורים והניחו לנייר להתייבש באוויר.

השתמש במאדה פחמן כדי לצפות את הסריגים בשכבת פחמן בעובי של כ-20 nanometers. השתמש בזמן האידוי כדי לשלוט בעובי הרצוי. ניתן לקבוע את העובי לפי גוון האפור של הפחמן בהשוואה לגוון האפור של שכבת פחמן בעובי ידוע.

השרו את רשתות הפחמן השכבתיות בכלורופורם בתוך צלחת פטרי מזכוכית למשך חצי שעה כדי להסיר את ה-form var; ייבוש הרשתות לאחר ההסרה של ה-form var יביא ליצירת רשתות פחמן מחוררות (holy carbon grids) ביתיות. לאחר מכן, מאדו פחמן לשכבה דקה בעובי של כ-5 nm על גבי משטח מיקה שנותק לאחרונה. לאחר מכן, הניחו בזהירות את רשתות הפחמן המחוררות על פיסת נייר סינון מתחת למים מזוקקים.

במכשיר מאולתר, צפו את הפחמן הדק מפני השטח של המיקה אל פני המים והשקיעו אותו באיטיות על גבי רשתות הפחמן החוריות. הרימו את נייר הסינון עליו נמצאות הרשתות והניחו לו להתייבש. במנדף, התחילו בצביעה שלילית של קומפלקס האקסוזומים על ידי הכנת תמיסת uranyl formate טרייה בריכוז 2%.

כפי שמתואר בנוהל הכתוב, כסו את מבחנת התמיסה ביריעת נייר אלומיניום. כדי למנוע חשיפה לאור, יש להשתמש בתמיסה באותו היום. בצעו פריקה של זוהר (glow discharge) על רשת פחמן דקה באמצעות מכשיר לפריקת זוהר. לאחר מכן, הניחו פיסת פרפיל (parfilm) נקייה על משטח העבודה; טפטפו בעזרת פפטה שלוש טיפות בנפח 50 µL של תמיסת צבע uranyl formate על גבי הפרפיל. דללו את קומפלקס האקסוזומים לריכוז של כ-50 nM באמצעות בופר דילול. טפטפו בעזרת פפטה 4 µL מהחלבון המדולל על רשת הפחמן שעברה פריקת זוהר.

השאירו את הדגימה על הרשת למשך דקה אחת, ולאחר מכן ספגו את התמיסה השארית בעזרת פיסת נייר סינון באמצעות פינצטה. הפכו את הרשת מיד אל תוך טיפת הצבע הראשונה ושטפו את הרשת על ידי הזזתה קדימה ואחורה מספר פעמים למשך כ-10 שניות. חזרו על תהליך זה עבור כל אחת משלוש טיפות הצבע; לאחר השטיפה האחרונה, השאירו את הצבע על הרשת למשך דקה אחת נוספת.

לאחר מכן, ספגו את הצבע בעזרת נייר סינון. השאירו שכבה דקה של תמיסת צבע על פני השטח של הרשת והניחו לרשת להתייבש במכסה מופעלת (fume hood). מקמו את רשת הדגימה בתוך מחזיק הדגימות, ולאחר מכן הכניסו את המחזיק לתוך מיקרוסקופ אלקטרונים FEI TE nine 12.

בדקו את רשת הדגימה בהגדלה נמוכה כדי למצוא את הריבועים הצבועים בצורה הטובה ביותר. ריבוע תקין נראה כבעל תריסר חורים בממדים של כ-1 עד 2 מיקרומטרים עם אזורים צבועים כהים בתוכם. הפעילו את מצב המינון הנמוך (low dose mode) של ממשק המשתמש של FEI וכווננו את מוקד החיפוש (search focus) ואת מיקום החשיפה (expose position) במצב מינון נמוך.

הגדירו את החיפוש למצב שברים (fraction mode) עם אורך מצלמה של 1.5 מטרים. הגדירו את המיקוד להגדלה של 150 K והגדירו את החשיפה להגדלה של 50 K עם זמן חשיפה נמדד של שנייה אחת. בדרך כלל, משתמשים במאפיין ניתן לזיהוי על הרשת הן במצב חיפוש והן במצב חשיפה כדי לבצע את הכיוון.

אתרו את החורים בעלי הצביעה הטובה במצב חיפוש ושמרו את המיקומים. צלמו את הריבוע באמצעות מצלמת CCD. הטו את הדגימה ל-55 degrees וצלמו תמונה נוספת.

השוו בין שתי התמונות וזהו את החורים הזוגיים בשתי המיקרוגרפיות. החזירו את התבנית לזווית של אפס מעלות. השתמשו בערכת המינון הנמוך (low dose kit) כדי לצלם כל חור שזוהה במצב החיפוש בהגדלה גבוהה עם דה-פוקוס (defocus) של כ- 0.7- micrometers.

לאחר צילום כל החורים, הטה את הבמה ל-55 מעלות תוך שימוש באותה הגדלה. צלם מיקרוגרפים של הדגימה המוטה עם דפוקוס (defocus) של כminus 1.2 micrometers. זהה את זוג המיקרוגרפים התואם של ההטיה בהתבסס על התבניות במיקרוגרפים בהגדלה נמוכה, באמצעות התבנית הבלתי סדירה של רשתות הפחמן המנקובות (holy carbon grids) שהוכנו במעבדה.

כדי לסייע למתאם (correlation), בחרו זוגות של הטיה של מיקרוגרפים עם פיזור חלקיקים אחיד וללא הילות מסביב לחלקיקים. יש להשמיט את אותם מיקרוגרפים שבהם נראות הילות צבעה בולטות כדי לעבד את הנתונים. התחילו עם הגדרת התוכנית בהליך הפעולה.

עיבוד תמונה יודגם באמצעות תהליך 2D בחבילת Eman. כדי לשנות את פורמט התמונה, השתמש בחבילת iMagic five לביצוע יישור 2D ובחבילת spider. כדי לבצע שחזור וזיקוק בתלת-ממד, המר את תמונת ה-Gatan הדיגיטלית DM three לפורמט תמונה של spider.

באמצעות פקודת process 2D, בחרו את זוגות החלקיקים. באמצעות תוכנת האינטרנט המופצת בחבילת תוכנת ה-spider, התוכנה שומרת באופן אוטומטי את קואורדינאטות החלקיקים ומחלצת את כל החלקיקים שנבחרו באמצעות הסקריפט של spider. הסקריפט שומר את ערימות החלקיקים במצב מוטה ובמצב שאינו מוטה.

המיר את החלקיקים הבלתי-מוטים (UN tilted particles) לפורמט IMAG five. באמצעות תוכנת EM two EM, בצע סינון פס-מעבר (band pass filter) ומסוך את החלקיקים הבלתי-מוטים באמצעות פקודת InCorp prep ב-IMAG five, ומרכז את החלקיקים שעברו סינון פס-מעבר ומסוך באמצעות פקודת center. ב-IMAG five, בצע יישור וסיווג של החלקיקים באופן איטרטיבי למחלקות הומוגניות באמצעות סקריפט אצווה (batch script) המריץ באופן אוטומטי את תוכנות IMAG five.

בשלב הבא, השתמש בפקודה MSA names in class בתוכנת IMAG five כדי להפיק טבלת חיפוש (lookup table) של החלקיקים עבור המחלקה, והפק קובץ גרף עבור ערכי התרגום והסיבוב של היישור עבור כל חלקיק באמצעות פקודת ה-header. בתוכנת iMagic five, המר את החלקיקים המיושרים לפורמט spider באמצעות תוכנית EM two EM. לאחר מכן, המר את טבלת החיפוש של המחלקות לקובצי מסמכי spider.

ערכי התרגום והסיבוב של היישור עבור כל חלקיק מומרים גם הם לקובץ מסמך spider; החילו בעזרת מסנן מעביר פס (band pass filter) ומסכה, ומרכזו את החלקיקים המוטים בדיוק כפי שנעשה עבור החלקיקים שאינם מוטים ב-IMAG five, כדי להפיק סט נתונים חדש עבור חלקיקים מוטים ממורכזים. צרו קובצי מסמך זוויתיים מקובצי יישור הרב-רפרנס שהופקו מ-IMAG five ומקבצי ה-DCB שהופקו על ידי תוכנית האינטרנט. השתמשו בסקריפט back projection ב-spider כדי לקבל מודל ראשוני אחד עבור כל ממוצע מחלקה.

לבסוף, בצעו זיקוק של ההקרנה (projection refinement) של הנפח הראשוני באמצעות סקריפט ה-spider כנגד כל החלקיקים שאינם מוטים, כדי לקבל את הנפח הסופי באמצעות RCT. התקבלו כ-50 שחזורים של האקסוזום. הנפחים נוצרו מחלקיקים מוטים המתאימים לכל חלקיק ב-50 המחלקות של החלקיקים שאינם מוטים.

באמצעות השתמשות ב-back projection שיושם בחבילת spider, בוצע לאחר מכן זירוף של התאמת ההשחלה (projection matching refinement). תוך שימוש בנפחים אלו כמודלים ראשוניים, נוצר הנפח התלת-ממדי המוצג של האקסוזום ברזולוציה של כ-18 Å, ולאחר מכן ניתן להטמיע במפה התלת-ממדית את המודלים האטומיים של חלקים שונים מהקומפלקס. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן השימוש ב-RCT להשגת שחזורים תלת-ממדיים, החל מיצירת רשת דגימות איכותית, דרך צילום מיקרוגרפים של הדגימות, ועד להשגת השחזור באמצעות טכניקות של ניתוח תמונה. מלבד הפרוטוקול שתיארנו כאן, קיימות מספר שיטות נוספות להשגת השחזורים הסופיים בניתוח תמונה.

השלב הקריטי ביותר להשגת שחזור נכון ומהימן הוא עבודה עם דגימה שהוכנה היטב.