המצאה של המכשיר microfluidic עבור מידור של Neuron סומה האקסונים

ברוכים הבאים למעבדה של ד"ר Newly John. מעבדת John מתמחה בהנדסת פלטפורמות מיקרופלואידיות ליישומים ביולוגיים. בסרטון זה, נדגים את הייצור והשימוש במכשיר מיקרופלואידי שנועד להפרדה לתאים (compartmentalization) ולתרבית של נוירונים ראשוניים.

מכשיר הנוירון פורסם לראשונה ב-Nature Methods באוגוסט 2005. מאז הצגתו, נעשה שימוש נרחב במכשיר הנוירון על ידי שותפים למחקר מרחבי העולם. מכשיר הנוירון מורכב מחלק של PDMS שהוטבע על גבי פרוסת סיליקון המכילה תבנית SUA של המכשיר, אשר נוצרה קודם לכן באמצעות פוטוליתוגרפיה.

להתקן שלושה מאפיינים עיקריים: ארבעה מאגרי נוזלים, שקוטרם שמונה מילימטרים; שני תעלות ראשיות, שכל אחת מהן היא ברוחב 1.5 מילימטר, באורך שבעה מילימטרים ובגובה מאה מיקרון; וחריצים מיקרוסקופיים, שרוחבם 10 מיקרומטר וגובהם שלושה מיקרומטר, המחברים בין שתי התעלות הראשיות. אורך החריצים המיקרוסקופיים יכול להשתנות בין 150 מיקרון ל-900 מיקרון, אם כי האורך הסטנדרטי הנבחר הוא 450 מיקרון. בבחינת ההתקן כאשר התעלות הראשיות והחריצים המיקרוסקופיים ניצבים, ניתן לראות כי מאגרי הנוזלים משמאל לחריצים מחוברים באמצעות התעלות הראשיות, וכך גם מאגרי הנוזלים מימין.

מאפיין זה מאפשר לנוזלים לזרום דרך התעלה הראשית, דבר המהווה יתרון משמעותי המאפשר להטעין תאים ולהחליף מצע גידול. למכשיר הנוירונים ישנם שלושה יתרונות מרכזיים על פני פלטפורמות מסורתיות לתרבית רקמות. ראשית, הוא מאפשר הפרדה לתאים נפרדים של גופי התא או הסומה והאקסונים. באמצעות מכשיר הנוירונים, ניתן להפיק פראקציות אקסונליות טהורות.

הגודל והאורך של החריצים המיקרוסקופיים מאפשרים לאקסונים לעבור דרך הערוץ הראשי השני תוך מניעת מעבר של גופי התאים. שנית, בשל תכנון המכשיר ובניצול הלחץ ההידרוסטטי, ניתן להעביד את צד התאים ו/או את צד האקסונים של המכשיר בטיפולים נפרדים, פשוט על ידי שמירת הנפח והמאגרים בגובה רב יותר בצד אחד של המכשיר לעומת הצד השני. ושלישית, ניתן לנתק את פראקציית האקסונים הטהורה של המכשיר באמצעות שאיבת ואקום, מה שמאפשר לחוקר ללמוד ולצפות בהתחדשות אקסונלית.

החוקרת Hina Lee תדגים כעת את הכנת התקן המיקרופלואידי לנוירונים. עבור יציקת התבנית המיקרופלואידית מ-poly dimethyl siloxane (PDMS), נעשה שימוש בסיליקון וייפר בעובי 3 Ang עם תבנית המורכבת מ-SU-8 שנוצרה באמצעות פוטוליתוגרפיה. אנו מכנים את סיליקון הוייפר עם תבנית ה-SU-8 כתבניות מאסטר (master molds) או פשוט מאסטרים.

מערבבים PDMS עם חומר מעבד ביחס משקלי של 10 ל-1. כך, למשל, 15 גרם של PDMS לכל 1.5 גרם של חומר מעבד. לאחר מכן מערבבים את ה-PDMS היטב ומוזגים אותו על גבי פרוסת סיליקון.

פלטת הסיליקון מוצבת בתוך צלחת פטרי מפוליסטירן בקוטר 10 סנטימטר. נדרשים כמעט 12 גרם עד 15 גרם של PDMS כדי לכסות את ה-MAs בעובי של כארבעה מילימטר. לאחר מכן, התבנית עם ה-PDMS מוcephal-בתוך תא ואקום (desiccator) כאשר מכסה צלחת הפטרי פתוח, ומופעל ואקום.

פעולה זו נעשית כדי לסייע בהסרת בועות אוויר מה-PDMS שהוכנסו במהלך ערבוב חומר ההקשיה. נדרשים כ-15 דקות להסרת בועות האוויר. את התבנית עם ה-PDMS מוציאים מהמייבש לאחר 15 דקות במייבש הוואקום.

עדיין נותרו מספר בועות על תבנית ה-PDMS. נעשה שימוש בנשיפת אוויר עם מסנן של 0.45 micron כדי להסיר את כל הבועיות שנותרו. לאחר מכן, התבנית מונחת על פלטה חמה בטמפרטורה של 80 °C למשך שעה אחת לצורך הקשיה.

אם אין מכשיר ייבוש בוואקום (vacuum desiccator), ניתן להשאיר את התבנית בטמפרטורת החדר למשך מספר שעות. בועות האוויר יתפוגגו בסופו של דבר מעצמן. אם אין פלטה מחממת, ה-PDMS יתרפא בטמפרטורת החדר לאחר 24 שעות.

חשוב לוודא שהתבנית (master) מפולסת במהלך תהליך הפילם. לאחר שה-PDMS התגבש על התבנית, הוא מופרד ממנה באמצעות להב ניתוחי ומועבר למC-hood נקי. לאחר מכן, מבצעים חיתוך מעגלי מסביב להיקף המכשירים.

חשוב להחדיר את הלהב לתוך ה-PDMS כך שייצור מגע עם פרוסת הסיליקון, אך אין להפעיל לחץ רב מדי על הפרוסה, אחרת התבנית (master) תיסדק בחתך מעגלי מסביב להתקנים. בכל תבנית סיליקון של 3 אינץ' ישנם ארבעה התקנים. ה-PDMS מופרד בזהירות מהתבנית.

ניתן להתחיל זאת על ידי סיבוב עדין של הלהב הכירורגי בעת השחלתו לתוך החתך הקודם. השכבה דקה מאוד כאשר התקני ה-PDMS נמצאים על התבנית. מאגרים הפונים כלפי מעלה ננקבים במכשיר באמצעות מחורר ביופסיה לרקמות בקוטר שמונה מילימטרים.

השאריות שנותרו במנקב נדחפות החוצה באמצעות מוט. לאחר מכן, המכשירים מחולקים לרבעים ועודפי PDMS נגזמים כך שהמכשיר יתאים בדיוק למכסה של Corning. זכוכית מספר 1 בגודל 24 millimeter by 40 millimeter וזרם חנקן משמשים להסרת שאריות עודפות.

ניתן להסיר שאריות עקשניות גם באמצעות סרט ויניל מסוג 3M Scotch Brand 4 7 1. המכשירים הנקיים מוכנים כעת להדבקה בפלסמה. מנקה פלסמה מסוג herrick משמש להדבקה קצרה של מכשיר הנוירונים לכיסויי הזכוכית (cover slips).

המכשירים וזכוכית המכסה מונחים על מגש, ולאחר מכן המגש יוכנס למנקה הפלסמה ומשאבת ואקום תשמש לפינוי האוויר מתא המכשיר. חשוב לציין כי מכשירי ה-PDMS מונחים כשפניהם כלפי מעלה. כלומר, צד התכנון פונה למעלה כדי שיהיו חשופים לגז הפלסמה.

לאחר שלחץ הוואקום הגיע ל-300 millitorr, מופעל החשמל לסליל החשמלי ומוגדר לעוצמה גבוהה. פתח הדלת מעט כדי לאפשר כניסה של כמות קטנה של אוויר לתא, דבר שיסייע ביצירת הפלזמה. המכשירים וזכוכית הכיסוי עוברים טיפול בפלזמה למשך שתי דקות.

שימו לב לצבע הסגול בתא. זהו הפלסמה בפועל. הסליל החשמלי יוצר פלסמה, שהיא גז מיונן חלקית המורכב מאלקטרונים, יונים ואטומים או מולקולות ניטרליים.

הפלסמה יוצרת מינים ריאקטיביים על פני השטח של הזכוכית ושל המכשיר, אשר כאשר הם מונחים יחד, יצרו קשר קבוע. הפלסמה גם הופכת את פני השטח להידרופיליים, מה שמסייע בהוספת נוזלים. מנקה הפלסמה גם מעקר את המכשירים.

לאחר טיפול בפלזמה למשך שתי דקות, הכוח בוואקום כובה ואוויר מוזרם אל התא. המשטחים שעברו טיפול בפלזמה של הזכוכית וההתקן המיקרופלואידי מורכבים במגע זה עם זה בתא עבודה סטרילי (clean bench). לאחר מכן, ההתקנים מונחים בצלחות סטריליות של 60 מילימטר.

המשטחים המטופלים בפלסמה של הזכוכית והמכשיר יוצרים קשר בלתי הפיך והדוק. תוך 10 דקות מההדבקה בפלסמה, המכשיר מודבק לזכוכית ומוסיפים למכשיר polyol lysine. לאחר 10 דקות, ההידרופיליות של המכשיר תפחת.

הדבר מקשה על חדירתו של ה-PLL אל תוך המכשיר. חשוב לבדוק אם קייות בועות אוויר במכשיר לאחר הוספת ה-PLL. שיטה פשוטה להסרת בועות אוויר קיימות היא שימוש בפיפטה P 200 מלאה ב-100 µL של נוזל.

במקרה זה, יש להניח את קצה הפ pipette של ה-PLL ישירות בפתח התעלה הראשית, ולאחר מכן ללחוץ בעוצמה על ה-P 200. ייתכן שיהיה צורך לחזור על פעולה זו מספר פעמים, אך בסופו של דבר הכוח מה-pipette ידחוף את הבועות החוצה. המכשירים המכילים PLL נשארים לדגירה למשך הלילה באינקובטור סטנדרטי לתרביות רקמה ב-37 degrees עם 5%CO2.

לאחר 24 שעות של דגירה עם PLL, שוטפים את ההתקנים פעמיים במהירות במים דה-יוניזים שעברו אוטוקלאב. במהלך תהליך זה, אין להסיר את הנוזל לחלוטין מהתעלים הראשיים, אלא רק מהמאגרים. הסרת הנוזל מהתעלים הראשיים תגרום להיווצרות בועות.

לאחר שני שטיפות מהירות, המכשירים ממולאים שוב במים דה-יוניזים שעברו עיקור באוטוקלאב ומוחזרים לאינקובטור למשך שלוש שעות לפחות או למשך הלילה. למחרת, לאחר שהמכשירים דגרו עם מים למשך הלילה או למשך שלוש שעות לפחות, הם מועברים שוב למCבנטת הבטיחות הביולוגית ונשטפים פעמיים במים דה-יוניזים. לאחר מכן, למכשירים מתווסף מצע בסיסי עצבי (neural basal media) המכיל את התוספים הדרושים, B 27 וגלוטמט לגידול נוירונים ראשוניים של חולדה.

לאחר מכן, המכשירים מוחזרים לאינקובטור לשימוש עתידי. המכשירים מוכנים כעת להזרעת נוירונים. בסרטון זה, הדגמנו את טכניקת הליטוגרפיה הרכה, המשמשת אותנו לייצור מכשירי הנוירונים שלנו.

ניתן להשתמש במכשירים אלו לתרבית של נוירונים וסוגי תאים אחרים בעלי עניין. היתרון העיקרי של מכשירים אלו הוא היכולת להפריד ולחלק למדורות את התרבית של גופי התאים הנוירונליים בצד אחד של המכשיר מאקצירה אקסונלית טהורה בצדו השני של המכשיר. בסרטון הבא, נראה לכם כיצד אנו מכינים נוירונים קורטיקליים מעוברים של חולדה ביום E 18 וכיצד אנו טוענים את התאים לתוך המכשיר.

זהו כל הסיכום ממעבדה של ג'ון. תודה שצפיתם.