הדמיה ג elegans עוברים באמצעות מיקרוסקופ Epifluorescent ותוכנות קוד פתוח
24 במרץ 2011
ג elegans היא מערכת רבת עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא ופיתוח. אנו מציגים פרוטוקול הדמיה חיה של ג elegans עוברים ניצול אופטיקה DIC או באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescent זמינים מקור פתוח תוכנה.
פרוטוקול זה מדגים כיצד לצלם אירועים דינמיים בעוברים של CL egan בשלבים מוקדמים באמצעות אופטיקת Norky DIC או פלואורסצנציה, תוך שימוש במיקרוסקופים נפוצים ובתוכנה בקוד פתוח. הפרוטוקול נפתח בתיאור אופן הדיסקציה של עוברי CL gans והרכבתם לצילום. לאחר מכן, נסקור את ההגדרה הנכונה של אופטיקת DIC nor masky כדי להבטיח קבלת תמונות אופטימליות ברמת פירוט מקסימלית.
במאמר זה נסקר גם כיול של תאורה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשיטת epi בשדה רחב לצורך איסוף נתוני תמונות פלואורסצנטיות איכותיות בשילוב עם תוכנה בקוד פתוח. מיקרוסקופיה איכותית מאפשרת ויזואליזציה של דינמיקה תאית בעובר מתפתח. הדגמות ויזואליות של שיטה זו הן קריטיות, שכן הגדרה נכונה של ה-D iic Optics היא משימה מורכבת עקב טרמינולוגיה שעלולה לבלבל וטכניקה שקשה לתאר בכתב.
בנוסף, על החוקרים להקפיד לצמצם את החשיפה לאור בעת ביצוע דימות פלואורסצנטי. כדי להגביל פוטוטוקסיות ופוטובליצ'ינג (הלבנה פוטוכימית), ולהכין את העוברים לדימות, הכינו תחילה שני תמיסות קיבוע. אחת היא וזלין מומס והשנייה היא 2% עד 3% agarose בבופר.
ניתן להכין אגרוס (aros) בצפיפות גבוהה יותר אם המבנים המיועדים לדימוי שבירים מאוד, תוך הקפדה להימנע מרתיחה. שני תמיסות המלאי מומסות במיקרוגל ולאחר מכן נשמרות כאליקוטים של ארבעה עד חמישה מיליליטר. ביום הדימוי, המיסו אליקוט של תמיסת וזלין בבלוק חימום של 65 עד 70 degrees Celsius והמיסו אליקוט אחד של תמיסת אגרוס במיקרוגל.
שוב, יש להימנע מרתיחה. לאחר מכן, כדי לשמור על תמיסות אלו במצב נוזלי, אחסנו אותן בבלוק חימום. בשלב הבא, כסו את החלק העליון והתחתון של שתי זכוכיות כיסוי ברצועת סרט הדבקה למעבדה והניחו זכוכית נקייה בין שתי זכוכיות הכיסוי המודבקות.
כעת טפטפו מספר טיפות של ה-agar המומס על גבי זכוכית נושאת נקייה וכסו אותה עם זכוכית נושאת נקייה נוספת. ה-agar מתפשט לרפידה ריבועית דקה, ובכך מוכנה רפידת התולעים. השתמשו במיקרוסקופ סטריאוסקופי ובפינצטה מחוט פלטינה כדי להעביר שתי תולעים בוגרות לטיפה של 9 עד 12 µL של בופר על גבי לבידה של 18 על 18 מילימטר.
לאחר מכן גזרו. פתחו את התולעים בעזרת מחט או סקאלפל כדי לשחרר את העוברים, כאשר צד האגרו פונה כלפי מטה. מקמו את פדי התולעים על לוחית כיסוי של 18 על 18 מילימטר וגזרו בעזרת תער כל שארית אגר בולטת.
לבסוף, כדי לאטום את כיסוי הזכוכית, מרחו את תמיסת הוואזלין המומסת לאורך היקפו באמצעות מברשת צבע או קיסם. התאים מוכנים כעת לדימות. בעת הנחת הזכוכית על המיקרוסקופ, ודאו ששני המקטבים מיושרים בניצב זה לזה.
וודאו שגם הדיאפרגמות (wallers) וגם הפריזמות אינן נמצאות בנתיב האור. אם השדה אינו חשוך, סובבו את המקטב שמתחת למעבה עד שיהיה חשוך. אתרו את העוברים באמצעות העדשה של 10x.
חפשו קבוצות שלומיים צעירים בקרבת גופי התולעים כדי להשיג מספר עוברים בשדה הדמיя. כדי לקבל את התמונות הטובות ביותר, הימנעו מעוברים הנמצאים בתוך התולעה. לאחר איתור העוברים המתאימים ביותר, עברו לעדשה עם הגדלה גבוהה יותר.
כעת העבירו את קוביית המסנן למצב DIC. לאחר מכן, הכניסו את פריזמת וולסטון (Wollaston prism) העליונה של העדשה העצמית לנתיב האור וסובבו את המגדל בקונדנסור כדי לבחור את פריזמת וולסטון התחתונה התואמת לעדשה. כאשר הפריזמות במקומן, כווןנו את המחוון שמתחת למגדל זה כדי להתאים לממספר האפצ'רורה (numerical aperture) של העדשה.
כדי להשיג תאורת קולר (Kohler) אופטימלית, יש למקד את הקונדנסור עד שהקצה של דיאפרגמת הקונדנסור נראה חד ביותר. המצב החד ביותר הוא כאשר הגבול בין האור לחושך הוא הברור או הממוקד ביותר. כדי להשיג ניגודיות אופטימלית, יש לכוונן את דופן התפוח ואת הפריזמה על ידי סיבוב הכפתור שעל המחושק.
כעת המיקרוסקופ כמעט מוכן לשימוש. זהו הזמן לשלוט בפרמטרי הדמיה נוספים במחשב באמצעות micromanager ותוכנה בקוד פתוח. התחילו בהגדרת הגבר המצלמה (gain) לאפס.
לאחר מכן, העבירו את הגדרת שמירת הקבצים ל-tiffs של שמונה ביט, ולא 16 ביט. ניתן לנתח קבצי TIFF מאוחר יותר באמצעות תוכנות קוד פתוח כגון Image J. בשלב הבא, כווננו את רמת התאורה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת לרמות הרוויה. אם כל הפעולות בוצעו כהלכה, התמונה תיראה בתלת-ממד, כאשר האור נראה כמאיר מזווית מסוימת.
כעת, כאשר התמונה נראית ברורה, בחרו את העוברים שברצונכם לצלם וסמנו אזור עניין (ROI). אם למיקרוסקופ יש מנוע פוקוס, השתמשו בו כדי לאסוף מספר מישורי מיקוד בכל נקודת זמן. פתחו את חלון הרכישה הרב-ממדית והגדירו את המישור העליון והתחתון של ה-Z stack על ידי סיבוב כפתור הפוקוס כדי למצוא את מישורי המיקוד הראשוני והאחרון שבהם חלק מגרגירי החלמון נמצאים בפוקוס.
הגדירו את גודל הצעד. הגדרה זו תקבע את מספר מישורי המוקד שייאספו. כעת, הגדירו מרווח זמן ארוך מספיק כדי לרכוש את כל מישורי המוקד.
ניתן להגדיר את נקודות הזמן המקסימליות כגבוהות מאוד, כך שהתוכנה תצלם תמונות עד לעצירה ידנית. הגדירו את התוכנה כך שתציג רק את התמונה האחרונה שצולמה כדי שניתן יהיה לנטר את התהליך. כעת תנו שם לקובץ התמונות והתחילו ברכישת התמונות.
ניתוח תמונות ייסקר בקצרה בסוף הסעיף הבא. בניית סרט GFP דומה מאוד להפקת תמונות DIC ב-four D או Musky, אך נעשה שימוש בקובץ הגדרה הכולל בקרה תוכנתית של הסמיכה הפלואורסצנטית. לאחר מיקום העובריים, ודאו שפריזמת ה-walstone העליונה אינה נמצאת במסלול האור והעבירו את קוביית המסנן ל-F-I-T-C-G-F-P.
אם הגדרה זו לא בוצעה באופן אוטומטי בעת הפעלת התוכנה, ודאו כי הגבירות של המצלמה (camera gain) מוגדרת ל-255. קובץ התמונה מוגדר בפורמט tiff של 16 bit. כעת כבו את מקור האור המועבר ולחצו על live imaging.
כוון את עוצמת מקור אור ה-UV ואת זמן החשיפה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב עבור אות הפלואורסצנציה, אך שמור על חשיפה מינימלית לאור כדי לשמר את התאים. לאחר מכן, הגדר את מרווחי הזמן, את מספר נקודות הזמן ואת מספר מישורי המיקוד. כעת המשך ברכישת התמונות כפי שתושאר לאחור.
לניתוח הסרטים, השתמשו בתוכנה בקוד פתוח. Image J עם תוסף micromanager מותקן. ניתן לייבא סרטים גדולים מאוד ל-Image J באמצעות תוסף loci. זהו עובר מסוג wild type שצולם באמצעות nor masky, באופטיקת DIC.
החלק האחורי (Posterior) נמצא למטה מימין והחלק הבטני (ventral) נמצא למטה משמאל. הסרטון מציג רצף של תמונות במישור מוקד בודד שנאספו מדי 15 שניות. קצב ההשמעה מוגדר ל-14 פריימים לשנייה.
עובר זה מבטא פלואורסצנציה במהלך החלוקה העוברית הראשונה; כאן, הצד האחורי (posterior) נמצא בצד ימין למעלה. סרטון זה מציג את השינויים במישור מוקד בודד בכל 10 שניות. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הדמיית עוברים חיים באמצעות אופטיקת DIC Naski ופלואורסצנציית epi לצורך חקר אירועים דינמיים.
אנו מקווים שעתה יש לכם הבנה טובה יותר לגבי האופן שבו יש להגדיר את האופטיקה של DIC Nomar כדי לקבל תמונות אופטימליות, וכי הבנתם שניתן להשיג נתונים פלואורסצנטיים באיכות גבוהה באמצעות תאורת epi fluorescence, ושאינכם תמיד תלויים במיקרוסקופים מתקדמים יותר. תוכלו ליישם טכניקות דימוי אלו גם כדי לבחון עוברים החסרים תפקוד של גן ספציפי, במטרה לחקור לעומק את הדרישות הגנטיות עבור התהליכים המועדפים עליכם במהלך חלוקת התא או ההתפתחות.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מדגים דימות חי של עוברי C. elegans באמצעות אופטיקת DIC או פלואורסצנציה. הוא מספק שלבים מפורטים להכנת עוברי והתאמה אופטימלית של טכניקות הדימות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה התפתחותית
- טכניקות מיקרוסקופיה
רקע
- עוברי C. elegans מהווים מערכת מודל לחקר דינמיקה תאית.
- טכניקות של דימיון חי (Live imaging) חיוניות לצפייה בתהליכי התפתחות.
- הגדרה נכונה של ציוד הדימיון היא קריטית לקבלת תוצאות באיכות גבוהה.
- צמצום החשיפה לאור חשוב למניעת פוטו- độcסיות (phototoxicity).
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מקיף לדימוג של עוברים של *C. elegans*.
- העמקת ההבנה של הדינמיקה התאית במהלך השלבים המוקדמים של ההתפתחות.
- שימוש בכלי מיקרוסקופיה נגישים ובתוכנות בקוד פתוח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדסקציה והרכבה של עוברי C. elegans.
- כיול של אופטיקת DIC והגדרות פלואורסצנציה.
- שימוש בתוכנה בקוד פתוח לרכישת תמונות וניתוחן.
- אופטימיזציה של פרמטרי הדמיה להשגת תמונות באיכות גבוהה.
תוצאות עיקריות
- הצלחה במיפוי תמונה של אירועים דינמיים בעוברים של C. elegans.
- הוכחת חשיבותו של הגדרה אופטית נכונה להשגת בהירות.
- מתן הנחיות לצמצום החשיפה לאור במהלך המיפוי.
- סייע באיסוף נתוני תמונה רב-ממדיים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר דימוי יעיל של עוברי C. elegans.
- טכניקה והגדרה נכונות הן קריטיות להצלחת הדימוי.
- תוכנה בקוד פתוח משפרת את הנגישות עבור חוקרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי חי של עוברים של C. elegans מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של תהליכים תאיים כגון הרכבת כרומוזומים וציטוקינזה, ובכך מספק ביטחון ניבוי בתיקוף מטרות עבור תוכניות גילוי מוקדמות. הפרוטוקול עושה שימוש במיקרוסקופיה נגישה ובתוכנה בקוד פתוח כדי לתמוך בסריקה פנוטיפית ניתנת לשחזור ובקנה מידה רחב במערכת רלוונטית למחלה עם שושלת ידועה ויכולת מניפולציה גנטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה ישירה של אירועים תאיים דינמיים in vivo.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרת תפקוד גנים במסלולים התפתחותיים באמצעות רפורטרים פלואורסצנטיים או ניגודיות DIC.
- ערך חיזוי: מסייע בזיהוי מובילים (leads) על ידי קישור הפרעות גנטיות לתוצאות פנוטיפיות במודל עוברי בעל נאמנות גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף להערכת תרכובות בשלבים הבאים, באמצעות תהליכי עבודה סטנדרטיים של קיבוע עוברים והדמיה.
- תוצרים כמותיים: מאפשרת רכישת Z-stacks בשיטת time-lapse ונתונים רב-ממדיים למדידה הדירה של דינמיקה תאית.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מנצלת מיקרוסקופים אפי-פלואורסצנטיים זמינים ותוכנות קוד פתוח כדי להפחית את התלות בתשתיות הדמיה ייעודיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מקשר בין מנגנונים תאיים בסיסיים לפנוטיפים התפתחותיים עם פוטנציאל להתאמה של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
- המשכיות פרה-קלינית: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת נתונים דינמיים ברזולוציית שושלות תאים ממחקרי הפרעה גנטית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מפחיתה עמימות בתיקוף מטרות על ידי תצפית בזמן אמת על השלכות של השתקה גנטית (knockdown) או מוטציה על האמבריוגנזה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי מוקדמים על ידי כך שהיא מאפשרת בדיקת השערות, הבהרת מסלולים וסריקה פנוטיפית לפני שלבי אופטימיזציית המולקולות המובילות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובצמצום סיכונים ביולוגיים באמצעות דימיון חי של חלוקות תאי עוברי ומעברים התפתחותיים.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה ושחזור של בדיקות באמצעות קיבוע מבוקר של העובריים, כיול תאורה ורכישת נתונים בקוד פתוח.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות כגון עוצמת פלואורסצנציה, מורפולוגיה גרעינית ותזמון של ציטוקינזה לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני על ידי קישור פנוטיפים עובריים להפרעות גנטיות הרלוונטיות למודלים של מחלות אנושיות.
- שימוש חוזר בארגון: מבססת יכולת דימיון ניתנת לשימוש חוזר במגוון פרויקטים החוקרים מנגנונים תאיים שמורים במודלים ניתנים למניפולציה גנטית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בבקרת תהליכים תאיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים ותאימות לתוכנות קוד פתוח.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי אספקת נתונים פנוטיפיים מוקדמים in vivo המפחיתים סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על חומרת הפנוטיפ והביטוי שלו בהתפתחות עוברית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ב-C. elegans, בדיסקציה של עובריו ובטכניקות קיבוע.
- תלוי במיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי תקין עם אופטיקת DIC, קוביית מסננים ומנוע פוקוס עבור Z-stacking.
- מחייב סטנדרטיזציה של רמות התאורה, זמני חשיפה והכנת תמיסת הקיבוע בין המשתמשים השונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור רקעים גנטיים שונים או זני מוטציה המשפיעים על חיוניות העוברים או המורפולוגיה שלהם.
- כולל מגבלות מעשיות כגון סיכון לפוטוטוקסיות במהלך דימוי פלואורסצנטי וסחיפת עוברים במהלך רכישות ארוכות.
