מיפוי יישומים הביטוי Flippase Enhancer-מלכודת הזחל וגם למבוגרים תסיסנית CNS

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לדייק את הביטוי של GAL4 באמצעות שימוש בליפאז ספציפי לרקמות עם כלי המרה של GAL80. דבר זה מושג על ידי יצירת אוסף של זני זבובים טרנסגניים מסוג enhancer trap Flip (ET-FLP) וקביעת דפוס הביטוי של הליפאז ב-CNS בכל זן. באמצעות רפורטר GFP, ניתן להבחין ב-IMMUNOCHEMISTRY ובדיווח GFP בין ביטוי של GL לביטוי נוירונלי, כדי להצליב את ביטוי ה-GAL4 בזנים רלוונטיים של ET-FLP עם זבובים הנושאים כלי המרה של GAL80 בצאצאים.

ניתן להשתמש בניתוח קלונאלי כדי לנתח את דיוק הביטוי של GAL4, כגון בעין. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שניתן להשתמש בקווי תאומה מבוססי רצפי מגבירים (enhancer track), יחד עם כלי המרה של GAL80, עם אוסף מהיר של קווי GAL4 שכבר זמינים בקהילת הזבובים. בנוסף, ניתן להרחיב קונספט זה לאורגניזמי מודל מתעוררים אחרים המשתמשים ב-GAL4 UAS, כגון דגי זברה.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במיפוי מעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגות. למרות שפרוטוקול זה מדגים את השימוש ב-flip base בתת-קבוצה של תאי פוטורספטורים, ניתן להחיל את השיטה האינטרסקציונלית על ניתוח של רקמות אחרות, כולל רקמות שאינן עצביות, ככל שיתאפיינו קווי enhancer trap lipase נוספים.

מערכת GAL4 היא טכניקה חשובה המשמשת באופן נרחב על ידי ביולוגים החוקרים זבובים. הסתייגות אחת מרוב קווי GAL4 היא שהביטוי שלהם רחב מדי מכדי שישמשו למיפוי התנהגותי של המוח באמצעות שיטות פגיעה (finger methods). לא ניתן לדייק את ביטוי ה-GAL4 בתאים רצויים מבלי להשתמש בטרנסגן ELF-flip כדי להגביל חלקית את קווי הביטוי של GAL4.

ראשית, מועיל להכיר את דפוס הביטוי של טרנסגן ET flip x two בזחליים בשלבי התפתחות מאוחרים ובבוגרים כדי להמחיש את ביטויו של flip a במערכת העצבים המרכזית (CNS). בצעו הכלאה בין זכרים הנושאים את טרנסגן ET t flip X two הרלוונטי לבין נקבות בתולות הנושאות רפורטר GFP לביטוי של et flip מהצאצאים. אספו זחלי F1 בשלב השלישי (third instar) בשלב הנדודים לצורך נתיחה. הניחו אותם בתוך צלחת S guard נקייה, הסירו פסוליות בעזרת מכחול ושטפו את הצלחת פעם אחת עם 1x PBS.

כעת מלאו את הצלחת ב-1x PBS קר מאוד כדי להרדימ את הזחלים; כדי לגשת למערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחל, אחזו בוו הפיה באמצעות פינצטה. תפסו את הקוטיקולה סמוך לסוף anterior הכדורי המוארך וקלפו אותה לאחור. ה-CNS נשאר מחובר לוו הפיה יחד עם מבנים אחרים.

כעת, בעזרת פינצטה, הסר את כל המבנים העודפים המקיפים את ה-CNS תוך כדי נתיחה של ה-CNS. העבר אותם באופן פרטני לכלי Pyrex בעל שלוש תאים המלא ב-PBS. לאחר נתיחת כל ה-CNS, קבע אותם על ידי טבילה מלאה ב-200 microliters של 4%PFA על קרח.

אם מערכת העצבים המרכזית (CNS) צפה, סימן שלא נוקתה לחלוטין מכל הרקמות הסובבות. במקרה זה, יש להשתמש בפינצטה כדי להשקיע שוב את ה-CNS בתוך חומר הקיבוע למשך 15 דקות, לשטוף את הרקמה ב-PBS קר במיוחד 3 פעמים, ולאחר מכן לשטוף את הרקמה שלוש פעמים נוספות ב-PBT קר במיוחד. כעת הרקמה מוכנה לדימוי, לסיומון באמצעות נוגדנים או לאחסון ב-PBT בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

צביעה מאותו שבב ששימש להפקת הזחלים לאיסוף בוגרי F1 לפני הניתוח. טבולו חמישה עד 10 זבובים ב-95% ethanol מקורר למשך 30 שניות כדי להסיר את השעווה מפני השכבה החיצונית (cuticle). להסרת האתנול, שטפו את הבוגרים שלוש פעמים ב-1x PBS קר מאוד, ולאחר השטיפה השלישית, העבירו אחד מהם לכלי sil guard של 35 מילימטר מלא ב-1x PBS קר מאוד כדי להכין את הבוגר לניתוח.

הנח את הדגימה כאשר הצד הגבני (ventral) פונה כלפי מעלה והחדר סיכת מיניון למרכז הבטן. התחל את הניתוח באמצעות פינצטה להסרת הרגליים. לאחר מכן, הסר את קוטיקולת הראש על ידי קיבוע הראש בתומכים וקילוף סימולטני של הקוטיקולה מתחת לעין לכיוון החלק העליון של הראש.

בעזרת פינצטה מחודדת, הסר בזהירות את רקמות העטיפה שסביב המוח, כיוון שלרקמות אלו יש אוטופלורסצנציה חזקה הגורמת למוח לצוף במהלך הקיבוע. המוח הוא רק חלק ממערכת העצבים המרכזית (CNS) של הפרט הבוגר. החלק השני הוא החבל העצבי הבטני (ventral nervous cord או VNC) בחזה, וגם אותו יש להוציא בדיסקציה.

ראשית, הסר את הקוטיקולה של החזה על ידי קיבוע הזבוב בבסיס הרגל האחורית ומשיכה עדינה של הקוטיקולה של החזה עד לבסיס הצוואר. שנית, כדי לחשוף את ה-VNC, פרוש בעדינות את שני חצאי הקוטיקולה של החזה. שלישית, הסר את הבטן מהחזה על ידי קיבוע בבסיס הרגל השנייה ומשיכת הבטן הרחק מהאזור הסמוך לפסגית הבטן הראשונה.

רביעי, נקה את ה-VNC על ידי קיבוע באזור ההומרוס וקריעה עדינה של הרקמה המקיפה את ה-VNC. קרע את טבעת רקמת החיבור המקיפה את החיבור הצווארי והמשך להסיר רקמה עודפת תוך כדי איסוף המוח. העבר את המוח ואת ה-VNC כזוגות לתוך צלוחית Pyrex של 9 well המלאה ב-1x PBS מקורר שנשמר על קרח.

כדי לקבע את רקמות הבוגר, טבול אותן ב-4%PFA על קרח למשך 15 דקות. לאחר מכן, בצע שלושה שטיפות ב-PBS קר מאוד ושלושה שטיפות ב-PBT. הרקמה מוכנה כעת לדימות או לסמימה באמצעות נוגדנים כדי לנתח את ביטוי הגן התוצאה (transgene) בדייקנות.

מועיל לסמן את ה-CNS באמצעות סמנים עצביים או גליאליים כדי לספק מסגרת התייחסות; התחילו בהדגרה של הרקמה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לילה עם נוגדנים לעצבים או לגליות. למחרת, שטפו את הדגימה חמש פעמים ב-PBT והדגירו עם הנוגדן המשני הפלואורסצנטי בטמפרטורת החדר למשך שעתיים. עטפו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי למנוע פוטו-בליצ'ינג של הנוגדן עם סיום ההדגרה.

שטפו את הדגימה ב-PBS והעבירו אותה ללוחית זכוכית (whole mount). השתמשו בטבעת פלסטיק של OSHA כדי למנוע מהרקמה להימעך על ידי זכוכית הכיסוי. מערכת העצבים מוכנה כעת לבחינת דפוסי ביטוי של GFP ו-LL תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

בדרך כלל בוחנים שלושה עד חמישה חזרות כדי לקבוע את השחזוריות של תבנית הביטוי של flip. ניתן להשתמש בתבנית הביטוי של flip בקו flip, יחד עם טרנסגנים אחרים, כדי לשנות את האופן שבו מבוטא הרסרסור GAL four GAL 80. שינוי הביטוי של הרסרסור GAL 80 הוא שיטה יעילה לביצוע שינויים.

בביטוי GAL4, שיטה אחת היא להוציא (flip out) את ביטוי GAL80 באמצעות טרנסגן; ביטוי של GAL80 מנטרל את GAL4, אשר אחרת מניע דגנרציה של העין ברחבי העין. קו ה-ET flip בעל הסימון 6 88 A משמש כאן כדי להעריך את יעילותו של כלי ההמרה של GAL80 בתת-קבוצה של פוטורצפטורים בצאצאי F1, ולהשוות את הפנוטיפ של העין לפנוטיפ של העין בזני ההורים. כל הופעה של עיוות בעין או דה-פיגמנטציה מאשרת כי דפוס הביטוי של ה-flip קיים בפוטורצפטורים וכי ה-flipout של GAL80 הצליח.

אסטרטגיה משלימה שאינה כפולה היא להכניס ביטוי של GAL 80 באמצעות אותו קו flip רלוונטי. אסטרטגיה זו דומה מאוד לשנייה, אך כעת פיגמנטציית ה-ID ודגנרציה בצאצאי ה-F1 מודכאות. ב-flip X שני.

ביטוי של פטורצפטורים לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע את הדיסקציה של ה-CNS בערך בחמש דקות עבור בוגרים ובדקה אחת עבור זחלים, במידה והיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש בפינצטה חדה כדי להסיר את הטרכאה ואת הרקמות שסביב גם בבוגרים וגם ב-Libre C ו-Ss. חשוב להשתמש בצלחת לדיסקציה שאינה מכילה חומר מקבע. כיום נעשה שימוש ב-Heat shock flip ליצירת קלונים אקראיים.

בניגוד לכך, שיטת enhancer trap flip מאפשרת להפיק שיבוטים הניתנים לשחזור, מה שמקל על ניתוחים מורפולוגיים והתנהגותיים. יתרון נוסף של שיטת ה-finger הוא שניתן להגביל עוד יותר את תבניות הביטוי של GAL4 באמצעות שימוש בקווי anan trap flip נוספים ובקווי gal אחרים. חיסרון של תצורת tubulin stop GAL80 הוא ששילובים מסוימים של אפקטורים של GAL4 ו-UAS, כגון GAL4 ו-UAS-Kir, אינם תואמים מכיוון שהם יובילו למות הזבובים.

ניתן להתגבר על בעיה זו בקלות באמצעות שימוש באפקטור UAS מותנה, כגון UAS Shiri Ts, המאפשר לבחון התנהגות בטמפרטורות מגבילות כצפוי. לא כל קווי הליפאז מסוג enhancer trap יבטאו רמות ליפאז גבוהות מספיק כדי להיות יעילים. עם זאת, טכניקת האצבע המתוארת כאן מספקת גישה חדשה לחוקרי דרוזופילה לזיקוק ניתוח פסיפס (mosaic analysis), הן עבור מעגלי התפתחות והן עבור התנהגות.