נוהל הנדסה ריאות

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק בתרבית רקמת ריאה שדומה מבחינה מורפולוגית ופיזיולוגית לרקמת ריאה טבעית. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הוצאת הלב והריאות מחולדה בוגרת. השלב הבא הוא ביצוע קניולציה לעורק הריאתי ולשוואו (trachea), וחיבור הריאות שעברו קניולציה לביוראקטור לצורך דסלולריזציה.

לאחר דקלולריזציה ושטיפה, הריאה מועברת לביוראקטור סטרילי לתרבית ומוכנה להזרעת תאים. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הזרעת אוכלוסיית תאים מוכנה למדור הרצוי בריאה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות כי המטריצה החוץ-תאית שעברה דקלולריזציה התאוכלסה ביעילות בתאים המבטאים סממנים ריאתיים ספציפיים אזוריים, כפי שניתן לראות במיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לתרבית תאי ריאה in vitro הוא שהתאים שומרים על פנוטיפים מובחנים למשך תקופה ממושכת, כך שניתן לחקור אותם במשך מספר שבועות בסובסטרט תלת-ממדי ממקור ביולוגי. לצורך דה-צלולריזציה, הריאות מחוברות למכסה הביוריאקטור באמצעות קנולה וסקולרית, והמכסה מחובר למכשור הדה-צלולריזציה. הבקבוק מזכוכית שמעל הריאות מוחזק במקומו על ידי מעמד טבעות ותפס המחוברת אליו.

בשלב זה, ניתן להסיר את החומר התאי כדי להפיק פיגום של מטריצה חוץ-תאית, שניתן לאכלס מחדש בחומר תאי. הרכבת הביוראקטור לזריעה וטיפוח של רקמת ריאה מהונדסת מוצגת בדיאגרמה זו. מחבר ה-lure lock של הקנולה הקנהית מתחבר למעגל נשימה שבין מאגר הקנה לבין התא הראשי.

לולאת הנשימה כוללת שני שסתומים חד-כיווניים. מיקומם מאפשר למדיום לעקוב אחר נתיבים שונים בכניסתו ובצאתו מהריאה. מאגר קטן משולב זמנית בקו הפרפוזיה לצורך זריעה של תאי אנדותל.

משאבה פולסטילית משמשת להעברת תאים מהמאגר למדור הכלי הדם של הריאה. פרפוזיה של כלי הדם מתבצעת באמצעות משאבת גלילים. מצע מופנה לתוך העורק הריאתי דרך הקנולה המחוברת, זורם דרך כלי הדם של הריאה ויוצא מהוריד הריאתי ישירות לתוך הביוריאקטור הראשי, ממנו נשאב המצע לצורך הפרפוזיה.

את האפיתל הריאתי ממקמים על ידי הזרקה בתוך לולאת הנשימה. התא הראשי המכיל את הריאה וממאגר הקנה משמשים לתרבית ריאה לטווח ארוך. כאשר הריאות הוצאו והעורק והקנה קנתרו בצורה נכונה, הריאות שהוצאו זה עתה צריכות להחזיק אוויר ללא דליפות.

ניתן לוודא זאת על ידי ניפוחם באוויר בזמן שהם טבולים בנוזל. לא אמורות להופיע בועות המעידות על דליפות אוויר. כדי להתחיל בפרוטוקול, מנפחים את הריאות ב-PBS המכיל sodium nitropress side עד שהריאות מלאות אך לא מנופחות יתר על המידה, ולאחר מכן סוגרים מיד את הקנולה הקנה כך שהריאות יישארו מנופחות.

בשלב הבא, בצעו פרפוזיה לריאות עם PBS ו-SNP למשך 15 דקות לפחות בלחץ של 15 millimeters of mercury. לאחר מכן, הסירו את הפקק מקנולת הקנה כדי לאפשר לריאות להתרוקן מאוויר. המשיכו בפרפוזיה עם PBS ו-SNP למשך 15 עד 30 דקות במידת הצורך.

מלאו מחדש את ה-PBS וה-SNP כדי להבטיח שלחץ הפרפוזיה נשמר בטווח של 10 עד 15 מילימטרים של כספית. כדי להתחיל בתהליך דה-צלולריזציה ממושכת, מחברים את מכסה הביוריאקטור למערכת הדה-צלולריזציה. לאחר מכן מחברים את הריאות למכסה.

באמצעות חיבורי ה-lure lock המחוברים לקנולה בצורת Y, יש לחבר את קנולת העורק הריאתי לקו הפרפוזיה ואת הקנולה הקנהית להשאיר לצוף באופן חופשי. כדי להבטיח דצלוולריזציה מלאה של הרקמה, קריטי למנוע חדירת אוויר למערכת. השסתומים החד-כיווניים בקנולה העורקית ובקנולה הקנהית מסייעים בפינוי בועות אוויר מהצינוריות על ידי מתמטרת זרימה הפוכה בצינוריות.

לפיכך, יש לאפשר להוציא בועות אוויר באמצעות מזרק, ולהבטיח שכל הקווים נקיים מאוויר. התחל בפרפוזיה עם תמיסת דה-צלולריזציה. בצע פרפוזיה עם תמיסת דה-צלולריזציה.

עד ש-500 milliliters של תמיסה יזרימו דרך הריאות, הלחץ האופטימלי הוא פחות מ-15 millimeters of mercury. פעולה זו תדרוש בדרך כלל 2.5 שעות. קצבי הזרימה הם בדרך כלל איטיים מאוד בתחילה, ועולים במהירות במהלך השעה השנייה לכ-one milliliter per minute או יותר.

במהלך הפרפוזיה, הסר באופן תקופתי את נוזל הדסלולריזציה המשומש מהביוריאקטור, תוך הבטחה שנותרה כמות נוזל מספקת לתמיכה בריאה ובקנולה של הקנה. עם סיום הפרפוזיה בנוזל הדסלולריזציה, העבר את הריאות ואת הביוריאקטור למכבסת תרביות רקמה. כדי להתחיל את שטיפת האיבר, הסר את צנצנת ה-500 milliliter המכילה את נוזל הדסלולריזציה והחלף אותה בצנצנת סטרילית המכילה עד ליטר אחד של PBS סטרילי.

השתמשו בשאיבה בוואקום או במזרק כדי לוודא שהקוים נקיים מאוויר, והזרימו PBS דרך כלי הדם בלחץ של 10 עד 15 millimeters of mercury באותו האופן. בדומה לתהליך הדה-צלולריזציה, הסִירו מעת לעת את ה-PBS המשומש מהביוראקטור באמצעות טכניקות סטריליות, והחליפו או מלאו מחדש את צנצנת ה-PBS. המשיכו בשטיפה עם PBS סטרילי וטרי עד ש-2.5 liters לפחות של PBS סטרילי יעברו בריפרוזיה דרך הריאות.

שלב זה יארך בדרך כלל יומיים מתחילת תהליך הדה-צלולריזציה ועד לסיום השטיפה. העבירו את הריאות למערכת ביו-ראקטור סטרילית חדשה המכילה PBS טרי בתוספת 10%FBS ו-10%Pen strep, וודאו שגם לולאת הפרפוזיה כולה וגם כל קווי דרכי הנשימה מלאים בנוזל. מעתה ואילך, ייעשה שימוש במשאבה פולסטילית כדי לבצע פרפוזיה לריאות בקצב של 5 millimeters per minute.

סטריליזציה של פיגום המטריקס החוץ-תאי של הריאה תבוצע על ידי פרפוזיה למשך לילה עם PBS המכיל 10%FBS ו-10% penicillin streptomycin. לאחר השלמת שלב זה, העבירו את הריאות לאינקובטור בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שעה אחת או עד להשגת שיווי משקל טרמי. כהכנה לטיפול ב-Ben Nase, השלב הבא הוא טיפול של הריאות ב-Ben Nase.

כדי להסיר שאריות DNA מכל ריאה, מלאו תחילה מזרק אחד של 10 milliliter בבפר Ben Nase Prewarm בלבד, ומזרק אחד של 10 milliliter ב-90 units per milliliter של Ben Nase המדולל בבפר Ben Nase. הפסיקו את הפרפוזיה של הריאות.

לאחר מכן, נפחו את דרכי הנשימה באמצעות בופר Ben Nase תוך הימנעות מהזרקת אוויר אל תוך הריאה. המתינו דקה אחת עד שהריאה תתרוקן מהאוויר. לאחר מכן, נפחו את הריאה באמצעות תמיסת Ben Nase.

שוב, יש להיזהר לא להחדיר אוויר לריאה לאחר הניפוח באמצעות Ben Nase. יש להניח לריאות ללא פרפוזיה או אוורור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. בתום השעה, יש לחדש את הפרפוזיה עם ה-PBS בתוספת 10%FBS ו-10%penicillin streptomycin שכבר נמצא בביוריאקטור, ולהמשיך בפרפוזיה לאורך הלילה ועד ליום המחרת.

לאחר שטיפה ועיקור, ניתן להכין את פיגום המטריצה החוץ-תאית הארוך לאוכלוסייה תאית מחודשת. החלף את תמיסת ה-P-B-S-F-B-S benzo ב-250 milliliters של מצע תרבית. בצע פרפוזיה למשך שעה אחת לפחות לפני הכנסת התאים, והחלף למצע תרבית טרי רגע לפני זריעת התאים.

ניתן להשתמש במקורות תאים רבים לצורך בנייה מחדש של איברים. כאן, תודגם בנייה באמצעות אוכלוסיית תאי אפיתל. ראשית, הכין מזרק המכיל 15 milliliters של תגסוס תאים של אוכלוסיית תאי האפיתל הרצויה.

בשלב הבא, מלאו את מאגר דרכי הנשימה ב-80 milliliters של תמיסת תרבית וודאו שכל קווי האוורור נקיים מאוויר. לאחר מכן, הניחו את הביוראקטור בתוך אינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius וחברו את משאבת המזרק לצורך אוורור. זרקו את התאים לתוך הריאות באמצעות בולוס מהיר בחד-פעמי, על ידי הזרקת 15 milliliter של תרחיף התאים לתוך הקנולה הקנהית.

יש לוודא שמסנני האוויר בביוריאקטור הראשי אטומים. לאחר מכן, יש להתחיל מיד "נשימה" איטית בודדת באמצעות משאבת מזרק כדי לשאוב 60 milliliters של אוויר מהביוריאקטור הראשי בקצב של שלושה milliliters לדקה. פעולה זו תימשך כ-20 דקות.

לאחר מכן, יש להניח לריאות להישאר במצב סטטי למשך כ-18 שעות. התחל בפרפוזיה וסקולרית איטית בקצב של כ-0.5 milliliters per minute. במהלך תרבית איברים, הפרפוזיה מבוצעת בדרך כלל בקצב של one to three milliliters per minute.

בשימוש במשאבה גלגלית במהלך תרבית אפיתליאלית, האוורור מסופק בדרך כלל בקצב רציף של נשימה אחת לדקה ובנפח נשימתי של 5 עד 10 milliliters. בשימוש במשאבת מזרק, אוויר נשאב ומוזרק באופן מחזורי לתוך הביוריאקטור כדי לדמות נשימה על ידי החלפה בין לחץ שלילי ללחץ אטמוספרי בתוך התא הראשי. בשל הצורך לשמור על אטימות של הביוריאקטור במהלך האוורור, יש להפסיק את האוורור מדי יום ולהחליף את האוויר בתא הראשי.

בנוסף, יש להחליף את המצע בערך כל שלושה עד ארבעה ימים. במהלך התרבית, יש להחליף בערך מחצית מהנפח הכולל בכל פעם על ידי תרבית של אפיתל ריאתי ואנדותל וסקולרי. באמצעות הפיגום המותקן בביוראקטור, אנו מסוגלים לייצר רקמת ריאה המסוגלת להשתתף בחילוף גזים לפרקי זמן קצרים.

צביעת המטוקסילן, אאוזין והמטוקסילן (H&E) סטנדרטית של ריאת חולדה טבעית מוצגת כאן לצורך השוואה עם צביעת H&E של ריאת חולדה שעברה דה-צלולריזציה. המטריצה החוץ-תאית הסופית לאחר הדה-צלולריזציה צריכה להיות נטולת חומרי תא לחלוטין ולשמור על המאפיינים המקרוסקופיים, המיקרוסקופיים והאולטרה-סטרוקטורליים של ריאה טבעית. צביעת ה-H&E תאפשר ויזואליזציה של כל שארית DNA הדבקה לפיגום כתוצאה מדה-צלולריזציה או שטיפה לא מספיקים, דבר החיוני להשגת תנאים אופטימליים לזריעת תאים ולתרבית עוקבת של הריאה.

הביוריאקטור אמור להניב תאים המפוזרים היטב בכל חמשת האונות של הריאה, ולספק כיסוי של כ-70% של פיגום המטריקס החוץ-תאי. תמונות אלו משוות בין ריאה טבעית לריאה שעברה אוכלוסייה מחדש כאשר הן נצבעו באימונופלואורסצנציה. עבור סממנים מרכזיים של הריאה, אוכלוסיית התאים המגודלת היא חיובית לחלבון הפרשה של תאי Clara (secretory protein C) ול-Aquaporin five.

הסמנים הרלוונטיים מוצגים באדום והגרעינים שצבעו ב-DAPI מוצגים בכחול בכל הפנלים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע הליך זה, מדציליולריזציה ועד להסרה, תוך ארבעה עד חמישה ימים אם הוא מבוצע כראוי.