שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

ניסוי זה נועד לזהות חלבונים קושרים ליפידים ולנתח אינטראקציה בין ליפידים לחלבונים בסביבת ממברנה מוגדרת של ליפידים. חלבונים של הומוגנאט תאים מדגגנים עם שלפוחיות ליפידיות שהוכנו זה עתה מפוספטידלין וסרמיד. לתערובת התגובה מוסיפים חרוזי מגנט מצומדים ל-Xin V כדי לעגן את החלבונים הקשורים לשלפוחיות הליפידיות לחרוזי המגנט. לאחר מכן, שלפוחיות ליפידיות-חלבון מופקות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (magnetic activated cell sorting).

כדי לזהות את התוצאות המודגמות של חלבון קשור לליפידים, השתמשו ב-SDS page Western blotting כדי להראות ניקוי של PKC אטיפיקלי אנדוגני ורקומביננטי ושל דומיין קישור ספציפי לסרמיד שהובעו בתאי MDCK. היתרון המרכזי של טכניקה חדשנית זו על פני שיטות קיימות כגון Eliza או ספקטרוסקופיה של תהודה פלסמוןית כמו קישור לפני-שטח, הוא שאינטראקציית החלבון-ליפיד מושגת בסביבה דמוית ממבנה וכי ניתן לנקות ולנתח את החלבונים הקושרים. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ואבחון של מחלות המערבות ליפידים, כיוון שבמחלות אלו, אינטראקציית החלבון-ליפיד הפיזיולוגית פגומה.

עבור חלק מהמחלות הללו, יעדי החלבון אינם ידועים כלל ויש לזהותם. כדי לתכנן טיפול מבוסס ליפידים, התחל עם SLEs ליפידיים שהוכנו מתערובת מיובשת של כמויות שוות (equimolar) של phosphatidyl serine ו-C 16 ceramide ב-100 µL של sical buffer. בצע סוניקציה למשך שעה לאחר הוספת 300 µL של sical buffer, מועשר ב-0.1 mM manganese chloride. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-12,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן השהה מחדש את משקע הוזיקולות הליפידיות הגדולות ב-100 µL של sical buffer. הוסף 1 nM של צבע פלואורסצנטי vibrant cm DII והדגר ב-37 °C למשך שעה כדי לאפשר ויזואליזציה של פראקציית ה-SLE לאחר הפרדה מקסימלית. השג משקע ורוד של phosphatidyl serine ceramide SLEs שצבעו vibrant cm dai על ידי צנטריפוגה, והשהה אותו מחדש ב-100 µL של tris buffer.

בשלב הבא, כדי להכין ליסאט תאים נטול דטרגנט, יש לבצע סוניקציה לתאים ב-300 microliters של בופר היפרטוני של 10 millimolar tris, hydrogen chloride המכיל מעכבי פרוטאז ופוספטאז, ולאחר מכן לסובב בצנטריפוגה. להסרת שקיעי ממברנה, יש להוסיף כעת את ליסאט התאים הצלול לסספנסיות הליפידית הפיזיקלית ולהדגיר את התערובת למשך שעתיים בטמפרטורה של ארבעה degrees Celsius. מכיוון שליסאטים של תאים עשויים להכיל ממברנות אנדוגניות עם phosphate aerin, מומלץ לנקות את הליסאט מממברנות אלו באמצעות שלבי צנטריפוגה נוספים.

הוסיפו לתערובת התגובה 20 µL של בופר קישור XNV ו-50 µL של תמיסה המכילה חרוזי מגנט המצומדים ל-XNV, הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, ובצעו מיון תאים מופעל מגנטית (magnetic activated cell sorting) כפי שמומלץ בפרוטוקול היצרן. לאחר מכן, נטרו את הפלואורסצנציה של CM DII בפרקציות השטיפה (flow through) והאלוציה באמצעות קורא פלואורסצנציה למיקרופלייטים כדי לקבוע את נוכחותם וכמותם של הליפידים בניסוי תחרות נוגדנים. כדי לאמת את סגוליות תגובת הקישור של A PKC לוסיקולות של ceramide phospho Seine, הדגירו 1 µg של נוגדן פוליקלונלי של ארנב נגד P KC Zeta עם ליזט של תאים למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן הדגירו עם הוסיקולות השומניות.

המשיכו עם ניתוח SDS page ו-immuno blotting של קישור החלבון ל-ceramide phosphate serine sles באלואט המקסימלי עבור שחזור in vitro של קומפלקס פולריות ליפידי-חלבוני. התחילו עם הכנת משקע ורוד של וזיקולות ceramide phosphate serine שצבעו vibrant cm DII כפי שהוצג קודם לכן; השעיו מחדש את הוזיקולות ב-100 µL של tri buffer, בתוספת 100 µM של gamma S GT P, 1 mM של GDP, ושילוב של חלבונים רקומביננטיים רלוונטיים. לאחר מכן, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 4 °C למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL של תמיסת מלאי 20x של X in V buffer ו-50 µL של חרוזי מגנט מצומדים X in V.

דגרו את התערובת תחת ערבוב עדין למשך 30 דקות נוספות בטמפרטורה של 4°C. המשיכו בביצוע מיון תאים מגנטי (magnetic activated cell sorting) באמצעות מערכת NX NV בהתאם להמלצות בפרוטוקול היצרן כדי להקל על השקיעה. הוסיפו לפרקיית האלוציה 10 µg של albumin טהור.

רכז את החלבונים באמצעות שיקוע weyl flue. השכבה התחתונה מורכבת מכלורופורם מתנול עם vibrant cm dii מועשר. הבין-שכבה החומית מכילה את החרוזים המגנטיים ואת החלבון המשוקקע.

כמת את וסיקולות השומן (lipid vesicles) על ידי זיהוי של cm dii ורוד וזוהר בפאזה האורגנית של כלורופורם-מתנול בתגובת weyl flu. השתמש בכמויות שוות של וסיקולות שומן כדי לנרמל את כמויות החלבון בין הדגימות, ובצע ניתוח באמצעות SDS page ו-Immuno blotting.

ליזט ללא דטרגנט של תאי MDCK המבטאים את PKC Zetta באורכו המלא, כאשר הקצה C מקושר לחלבון פלואורסצנטי ירוק או לדומיין קושר סרמיד. הקצה C של pkc. Zetta דגור עם phospho seine.

לאחר שטיפה (elution) של עמודת ה-max, נותחו וסיקולות הסרמיד והחלבונים באמצעות immuno blotting. מקטע הקישור לסרמיד C 20 Zeta, EGFP ו-PKC Zeta באורכו המלא השתחזרו מה-EIT של עמודת ה-max, באופן העולה עם הספציפיות והיעילות של פרוצדורת ה-lyx. ביקורת השלילה EGFP, שלא נקשרה לוסיקולות הסרמיד הסיריות שלנו, לא הייתה ניתנת לגילוי ב-eit.

כאשר Linx מושלם בשיטות נוספות כגון SDS page ו-western blotting או ניתוח פרוטאומיקה, ניתן לענות על שאלות נוספות, למשל אילו חלבונים נמצאים במתחם החלבון הקושר ליפידים. לאחר פיתוחו, LabX סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום מחקר השומנים הבודדים (S single lipid) לבחון אפופטוזה המושראת על ידי קרמיד וקיטוב תאי בתאי גזע עצביים ובתאים אפיתליאליים.