תפוקה גבוהה מדידה סיווג P אורגני דגימות סביבתיות

המטרה הכללית של הליך זה היא לסווג זרחן אורגני שעבר הידרוליזה אנזימטית בתמריות של דגימות קרקע או דשן. זאת מושגים תחילה על ידי מיצוי דגימות באמצעות תמיסת sodium hydroxide EDTA וכיוון ה-pH של התמריות. לאחר מכן, מדגגות תמריות מותאמות אלו עם שני תמיסות אנזימים שונות.

בפלטה בעלת 96 בארות, השלב הסופי הוא מדידת אורטופוספט ששוחרר על ידי האנזים באמצעות קולורימטריית מוליבדן כחול. בסופו של דבר, ניתן לסווג את מרבית צורות הפספורוס של מונו-אסטר ואסתר-דו-פוספט טבעיים בדגימות קרקע או דשן על בסיס שחרור דיפרנציאלי של אורטופוספט באמצעות שיטת הידרוליזה אנזימטית. ניתן לבצע שיטה זו בעלות נמוכה בכל מעבדה סטנדרטית.

היתרון המרכזי של שיטה זו על פני שיטות קיימות, כגון ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית של זרחן 31, הוא היכולת למדוד את הפוטנציאל של אנזימי קרקע טבעיים לשחרר אורתופוספט מתרכובות אפונה אורגניות בעתיד. לפיכך, נתונים המתקבלים בשיטה זו יכולים לסייע בחיזוי פוריות הקרקע או הפוטנציאל של הקרקע לשחרר כמויות מזיקות של אורתופוספט הזמין לאצות. הוסף 30 milliliters של תמיסת נתרן הידרוקסיד 0.25 molar לשני גרמים של דגימה רטובה או מיובשת בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters.

דגרו עם ערבוב למשך 16 שעות בטמפרטורת החדר. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-3000 ×g למשך 30 דקות, ולאחר מכן העבירו 100 µL לפקת מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mL המכילה כבר באפר אצטט. לדגימה המותאמת נפח כולל של 1 mL ו-pH של 5.0.

הכינו שני תמיסות סטוק המכילות 0.5 יחידות למיליליטר של acid phosphatase ב-10 מיליליטר של sodium acetate 0.1 מולארי pH 5 שהוכן טרי. כעת הוסיפו nuclease NP1 ליופיליז פתוח מ-Penicillium Citron לאחד ממבחנות ה-10 מיליליטר של תמיסות הסטוק של acid phosphatase עד לריכוז סופי של 2.5 יחידות NP1 למיליליטר, וערבבו בעדינות על ידי הפיכה מספר פעמים; סנטריפוגו את שני תמיסות האנזים ב-3000 ×g למשך 30 דקות. כדי לבנות עקומת כיול, התחילו בהוספת 1 מיליליטר של תמיסות סטוק של potassium phosphate 1 מילימולארי למבחנת סנטריפוגה של 1.5 מיליליטר ובצעו שבע דילוליות סדרתיות של 0.5 מיליליטר; השליכו את המבחנה הראשונה כך שטווח הדילול הסופי יהיה בין 20 nmol ל-0.625 nmol של זרחן.

כעת העבירו את תמיסות הסטנדרט של ORTHOPHOSPHATE לשתי העמודות האחרונות בלוחית, החל מ-0 NM orthophosphate בשורה A ועד 20 nm orthophosphate בשורה H לשלוש הבארות הראשונות של עמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP לשלוש הבארות הבאות בעמודה 10. הוסיפו 40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP פלוס NP.

לבסוף, הוסיפו 40 µL של בופר אצטט 100 mM לכל שש הבארות. כעת, כל אחת משש הבארות הראשונות בעמודה 10 צריכה להכיל 80 µL של תמיסה בשתי הבארות הבאות. הוסיפו 40 µL של תמיסת סודיום אצטט המכילה 10 M גלוקוז, שישה פוספט, ו-40 µL של תמיסת אנזימי PP פלוס GP.

עבור כל דגימה שנבדקת, חלק 40 µL של תמציות דגימה עם pH מותאם לבארות אחת עד תשע בעד שמונה שורות, לאחר שכל הדגימות חולקו. השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי לחלק תמיסס אנזימים של PP פלוס GP לעמודות אחת עד שלוש, PP פלוס GP פלוס NP 1 לעמודות ארבע עד שש, ובאפר נתרקיס אצטט 0.1 M לעמודות שבע עד תשע. בצע שלב זה במהירות כדי להבטיח שכל הדגימות יקבלו זמן דגירה שווה.

כסו את פלטת 96 הבארים במכסה והדגרו את הדגימות, תמיסות האנזים, הבקרות ועקומת הכיול במשך שעה אחת בדיוק בטמפרטורה של 37 degrees Celsius בתוך מים דה-יוניזים. הכינו 50 milliliters מכל אחת מארבע תמיסות הסטוק. תמיסה A חייבת להיות מוכנה מדי יום במהירות באמצעות פפיט רב-ערוצי.

הוסיפו 25 µL של SDS, 100 µL של תמיסה a, 20 µL של תמיסה B ו-50 µL של תמיסה C לכל הבארים בלוחית 96 בארים. כסו את הלוחית והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבסוף, מדדו את הבליעה ב-850 nm באמצעות קורא לוחות מיקרו עם אורך גל ניתן לכיוונון (tuneable microplate reader) ובסיוע אפליקציית גיליון נתונים.

ראשית, שרטטו את עקומת כיול הפספורס האנורגני עם 0 עד 20 nanomoles פספורס בציר ה-x וממוצע של מדידות בליעה (absorbance) כפולות בציר ה-Y, בצעו רגרסיה ליניארית ומצאו את משוואת קו המגמה הטוב ביותר. לאחר מכן, חשבו את רקע הפספורס האנורגני על ידי חישוב ממוצע הערכים בעמודות אחת עד שלוש, ואז החילו את עקומת הכיול על מערך הנתונים. כדי לקבוע את כמות הפספורס שנגזרה ממונו-אסטרים של פספורס שעברו הידרוליזה, חשבו את ממוצע ערכי הדגימה המשולשים מעמודות ארבע עד שש והפחיתו מהם את תמיסת אנזים הבקרה בתוספת רקע הפספורס האנורגני.

לאחר מכן, כדי לחשב את תכולת הפספורס מהפספורס שעבר הידרוליזה, DERs מחשבים את הממוצע של ערכי הדגימות המשולשות מעמודות שבע עד תשע ומחסירים מהם את תמיסת אנזים הבקרה פלוס הפספורס anorganic ברקע פלוס פספורס מונו-אסטר שעבר הידרוליזה מעמודות ארבע עד שש. פלטת 96 בארות טיפוסית מציגה תוצאות עבור שמונה דגימות ועקומת כיול. הבקרות נמצאות בעמודה 10.

העלייה בעוצמת הצבע בין עמודות אחת עד שלוש ובין עמודות ארבע עד שש נובעת מתרכובות זרחן מונו-אסטר שעברו הידרוליזה; בין עמודות ארבע עד שש ושבע עד תשע העלייה נובעת מתרכובות זרחן די-אסטר שעברו הידרוליזה. כאן נעשה שימוש בשיטה של הידרוליזה אנזימטית בקיבולת גבוהה כדי לנתח בהצלחה את התפלגות מחלקות הזרחן בתמציות של 0.25 molar sodium hydroxide ו-0.05 molar EDTA מדגימת קרקע מוורמונט. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד למדוד אורתופספט נטיבי, וכן תרכובות זרחן מונו-אסטר ודי-אסטר בתמציות קרקע או דשן באמצעות הידרוליזה אנזימטית.

טכניקה זו עשויה לסייע בסלילת הדרך עבור חוקרים בתחומי הכימיה הסביבתית וניהול חומרי הזנה לבחון את התנהגות ה-P האורגני במערכות קרקע או דשן אורגני.