נדיפים חיידקית משנית אפיון באמצעות Ionization electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS)
8 ביוני 2011
משני יינון electrospray ספקטרומטריית מסה (SESI-MS) מאפשרת זיהוי של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) ללא צורך המקדים כל המדגם. פרוטוקול זה מספק הוראות לאפיון (בתוך דקות) המהירה של VOCs חיידקי באמצעות SESI-MS.
יינון במיקרו-רסס חשמלי משני, ספקטרומטריית מסות או CS EMS מאפשרים ניתוח של חומרים נדיפים බැקטריאליים ללא צורך במעבד דגימה מוקדם. החלל מעל תרבית הבקטריות מודחק על ידי פחמן דו-חמצני אל תוך תא התגובה של ה-cssi. בעוד החומרים הנדיפים חוצים את תא התגובה של ה-SSI, הם עוברים דרך ענן הרסס החשמלי ומיוננים.
לאחר היינון, החומרים הנדיפים נמשכים אל תוך ספקטרומטר המסות לצורך ניתוח. עודפי גז נשיאה וחומרים נדיפים חיידקיים שאינם מגיבים עוברים דרך מסנן של 0.22 מיקרון כדי להסיר סוכנים חיידקיים, כאמצעי הגנה נוסף, ונפלטים למנדף כימי. בסופו של דבר, פרוטוקול CSI MS זה מספק טביעות אצבע של חומרים נדיפים חיידקיים בתוך דקות ספורות.
אנו צופים כי טכנולוגיה זו תוכל לשמש במגוון יישומים, כולל ניתוח נשיפה לאבחון מחלות זיהומיות, או אפילו במערכות מזון שבהן נוכל לזהות במהירות פתוגנים הנמצאים על המזון שלנו או בו. קיימים מספר יתרונות מרכזיים לטכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון GCMS, sift, MS ו-PT, RM S; ראשית, החומרים הנדיפים אינם דורשים טיפול מקדים כלשהו לפני הניתוח.
שנית, ניתן לפרק יונים ספציפיים בתערובת הנדיפה, דבר המקל על זיהוי התרכובת. ושלישית, התהליך מהיר. בדרך כלל הוא נמשך פחות מחמש דקות.
כדי לנתח כל דגימה, בחרו את הכלי המתאים לגידול התרבית, בהתחשב בדרישות הגדילה של המין, וכן בהולכה יעילה של חומרים נדיפים לספקטרומטר מסות. בהדגמה זו, בחרנו בבקבוקי מדיה סטנדרטיים מפירי בנפח 100 milliliter. החומרים הנדיפים הבקטריאליים מועברים לספקטרומטר מסות באמצעות זרם של גז נשא כדי להרכיב את הנשא.
חברו קווי גז לבקבוקי התרבית בעלי פקקים מהולתלים הכוללים לפחות שני פתחי Luer. הכניסו את קווי הכניסה והיציאה של הגז דרך פתחי ה-Lure, ואטמו כל פתח נוסף לפני תרבית הדגימות. הגבישו לחץ בכלי ושקיעו אותם במים כדי לבדוק דליפות.
דליפות גז הן גורם מרכזי לתוצאות לא טיפוסיות המתבטאות באותות יונים נדיפים חלשים או חסרים שמתפתחים במהלך הלילה. תרביות של e coli, K 12, ו-pseudomonas aerogen, PAO one בתוספת LB Lennox, תוך הכנת שני שכורים ביולוגיים עבור כל מין.
הכינו תשעה בקבוקי תרבית סטריליים המכילים 50 milliliters של LB Lennox ובקבוק אחד לא מחומץ שישמש כביקורת (blank). חומצו כל תרבית ללילה בשני בקבוקי דגימה כדי ליצור חזרות טכניות. דגרו את התרביות ואת הביקורת למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. כיוון שמערכת ה-CEMS תוכננה במיוחד לדגימה של חומרים נדיפים, הגבילו את השימוש במוצרי טיפוח בעלי ריח חזק לפני השימוש במכשיר.
סגרו את כל הכימיקלים הנדיפים במעבדה ובקרו את זרימות האוויר ככל האפשר במהלך הבדיקה כדי למנוע זיהום של המכשיר ושל קווי העברת הגז. בעבודה עם סוכנים ביולוגיים חיים, התקינו מסננים בעלי גודל נקבוביות מתאים בקו גז הנשאי. המסננים לא יפריעו להעברת חומרים נדיפים לתא התגובה של ה-sesi, אך עשויים להשפיע מעט על יעילות העברת הארוסול.
על מנת לוודא שספק המתח כבוי ושהמערכת פרוקה מחשמל, בדקו את נוריות החיווי בספק המתח וודאו שהן כבויות. ודאו שהמתח במולטימטר הוא אפס והאריקו את המוליכים החשמליים. בשלב זה, התקינו את תמיסת הריסוס החשמלי (electro spray) לצורך הניתוח.
במצב יונים חיוביים, אנו משתמשים בתמיסת ריסוס אלקטרוסטטי של 0.1% formic acid, 5% methanol ו-94.9% water. כדי להשיג עוצמת אות ויציבות אופטימליות, הפעל את גז הנשא carbon dioxide וכוון את קצב הזרימה לשני ליטר לדקה. הפעל לחץ על מאגר הריסוס האלקטרוסטטי כדי להתחיל את הזרמת תמיסת הריסוס האלקטרוסטטי לתא התגובה בקצב זרימה של חמישה ננולטר לשנייה. לאחר מכן, הפעל את ספק המתח וכוון את המתח ל-2.5 kilovolts.
המתח המופעל משפיע על עוצמת אות היונים ועל יציבות קונוס הריסוס החשמלי; עבור המערכת שלנו, מתחים שבין 2 kV ל-5 kV מספקים את התוצאות הטובות ביותר במצב יונים חיוביים. יש לנקוט משנה זהירות, שכן בשלב זה משטחי המתכת של מקור היינון עלולים להסב הלם חשמלי מסוכן. כעת, הגדירו שיטת כיוונון לניטור ספקטרום ה-SEMS.
בטלו את הסימון בתיבת הבחירה של רכישת ערוצים מרובים או MCA. הגדירו את זמן הרכישה ל-10 עד 15 דקות והתחילו ברכישת הנתונים. עקבו אחר הספקטרה של רקע גז הנשא ובצעו כיוונונים עדינים במתח המופעל כדי לקבל כרומטוגרמה יונית כוללת יציבה וסריקות הניתנות לשחזור.
המשך באיסוף ספקטרום ו-TIC למשך חמש דקות כדי להבטיח את ייצוב המכשיר. הזן את פרמטרי הרכישה המתאימים לניסוי שלך. הקלט ספקטרום רקע של גז נשיאה עבור ניסויים עתידיים.
לאיסוף ספקטרום רקע (blank). הפנו את זרימת גז הנשא דרך קווי המעקף, ולאחר מכן חברו את דגימת הרקע, כאשר השסתומים סגורים, לקווי ההעברה של המכשיר. פתחו את השסתומים המובילים לבקבוק הדגימה וסגרו את השסתומים של קווי המעקף.
לקבלת ספקטרומים הניתנים לשחזור, יש לאפשר למערכת להגיע לשיווי משקל במשך 30 שניות, זמן שבו הלחות בתא התגובה מתייצבת. כדי לוודא שהמערכת הגיעה לשיווי משקל, יש לעקוב אחר ה-TIC, אשר ישתנה במהלך תקופת שיווי המשקל ולאחר מכן יתייצב.
ברגע שהמערכת הגיעה לשיווי משקל, יש להתחיל באיסוף הספקטרום. לאחר איסוף הספקטרום, יש להסיר את בקבוק הדגימה על ידי פתיחה תחילה של קווי המעקף של גז הנשא, ולאחר מכן סגירה של שסתומי הדגימה.
ולבסוף, יש להסיר את בקבוק הדגימה. שטפו את המערכת עם גז הנשאי למשך שתיים עד ארבע דקות כדי להסיר את הלחות וחומרים נדיפים שנספגו מקווי ההעברה ולמנוע זיהום מצטבר בין דגימות. אספו נתוני טביעת אצבע נדיפה עבור כל דגימה חיידקית, תוך איסוף לסירוגין של ספקטרום רקע (blank) נוספים כדי להבטיח חיסור רקע יסודי.
טביעות האצבע הנדיפות במצב יוני חיובי עבור e coli ו-p aerogen, שגודלו באופן אירובי ב-LB Lennox למשך 24 שעות ב-37 degrees Celsius, הן מובחנות. בספקטרום הנדיף של e coli שולט indu ביחס מסה למטען של 118, בעוד שהספקטרום של pseudomonas aerogen מכיל מגוון רחב יותר של שיאי חלבון שניתן להוסיף.
בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב שתתעדו את פרמטרי המכשיר שביצעתם עבורם אופטימיזציה לצורך האנליזה שלכם, כגון המתח המופעל, הרכב תמיסת ה-electro spray וקצב זרימת גז הנשא. כמו כן, חשוב לשמור רשומות של ספקטרה מייצגת כדי שתוכלו לשחזר את האנליזות שלכם בעתיד. זכרו כי עבודה עם חיידקים פתוגניים ומתח גבוה עלולה להיות מסוכנת ביותר.
לפיכך, תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון הגבלת הגישה ל-css CMS במהלך הניסוי. כעת אתם אמורים להיות מסוגלים להפיק באופן הדיר באופן עקבי ספקטרום CSS ו-EMS עבור חומרים נדיפים בקטריאליים במערכת שלכם. בהצלחה.
סקירה כללית
ספקטרומטריית מסה באמצעות יינון אלקטרוספריי משני (SESI-MS) מאפשרת זיהוי מהיר של תרכובות אורגניות נדיפות (VOCs) מתרביות חיידקים ללא טיפול מקדים בדגימה. פרוטוקול זה מפרט את השלבים לאפיון יעיל של VOCs מחיידקים באמצעות SESI-MS.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ספקטרומטריית מסות
- מיקרוביולוגיה
- תרכובות אורגניות נדיפות
רקע
- SESI-MS היא טכניקה המאפשרת ניתוח של חומרים נדיפים חיידקיים.
- השיטה מבטלת את הצורך בהכנה מוקדמת של הדגימה.
- היא מספקת תוצאות מהירות, בדרך כלל בתוך חמש דקות.
- היישומים כוללים ניתוח נשימה למחלות זיהומיות וזיהוי פתוגנים במערכות מזון.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לאפיון מהיר של VOCs חיידקיים.
- הדגמת היתרונות של SESI-MS על פני שיטות מסורתיות.
- סיוע בזיהוי טביעות אצבע נדיפות של חיידקים.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת תרביות חיידקים במצע סטרילי.
- שימוש בפחמן דו-חמצני לדחיקת חומרים נדיפים מהחלל העליון אל תוך תא ה-SESI.
- יינון של חומרים נדיפים בתא התגובה של ה-SESI.
- ניתוח בספקטרומטריית מסות של החומרים הנדיפים המיוננים.
תוצאות עיקריות
- זיהוי מוצלח של טביעות אצבע נדיפות של חיידקים.
- זמן ניתוח מהיר של פחות מחמש דקות.
- יכולת לפרק יונים ספציפיים לצורך זיהוי קל יותר של תרכובות.
- אמינות והדירות מוכחות של התוצאות.
מסקנות
- SESI-MS היא כלי בעל ערך לניתוח חומרים נדיפים בקטריאליים.
- הטכניקה מציעה יתרונות משמעותיים על פני שיטות קיימות.
- יישומים פוטנציאליים משתרעים לתחומי הבטיחות של מזון ותחומים קליניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
זיהוי מהיר וללא סימון (label-free) של טביעות אצבע נדיפות של חיידקים באמצעות SESI-MS מאפשר אפיון מיקרוביאלי בתפוקה גבוהה ללא טיפול מקדים בדגימות, ובכך מאיץ את שלבי הגילוי והסינון המוקדמים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי בזיהוי מיקרוביאלי ומפחיתה סיכונים בתהליכי עבודה תרגומיים (translational workflows) במורד הזרם, על ידי אספקת פרופילים נדיפים חסונים וניתנים לשחזור. שילוב של SESI-MS בצינורות מו"פ משפר את קבלת ההחלטות לגבי תיק הפיתוח, על ידי מתן אפשרות להבחנה כמותית ומהירה בין מיני חיידקים לבין תרביות מעורבות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה מהירה של מסלולים מטבוליים מיקרוביאליים באמצעות פרופיל של חומרים נדיפים.
- תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות על ידי הבחנה בין סוגים ומינים של חיידקים על בסיס חתימות נדיפות.
- מסייע בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידות כמותיות ושחזירות של חומרים נדיפים.
- משפר את רמת הביטחון בחיזוי לבחירה ומיון של מטרות מיקרוביאליות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק טביעות אצבע נדיפות שעברו תיקוף לצורך סטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה.
- מספק תוצאות כמותיות המתאימות לסריקה בתופעת של תרביות מיקרוביאליות.
- מאפשר הערכה מהירה וניתנת להרחבה של השפעות תרכובות על מטבוליזם בקטריאלי.
- תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מערכות מיקרוביאליות מגוונות ללא טיפול מקדים בדגימה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פרופילי סמנים ביולוגיים נדיפים למערכות מיקרוביאליות הרלוונטיות למחלה, במידת הרלוונטיות.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות שמירה על קריאות חסונות של חומרים נדיפים.
- מפחית את הסיכון התרגומי על ידי אספקת נתונים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך השוואות בין מחקרים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון המבוססות על בידול טביעות אצבע תנודתיות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
טביעת אצבע נדיפה באמצעות SESI-MS משתלבת במפגש שבין גילוי מוקדם, סקירה ומחקר תרגומי, ומאפשרת מעבר חלק מבדיקת השערות לוולידציה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות ניתוח מהיר של חומרים נדיפים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הדירות של חומרים נדיפים לצורך הערכת תרכובים ומוכנות של בדיקות.
- אנליטיקה: מספקת ספקטרום מס ברזולוציה גבוהה ובידול סטטיסטי של דגימות חיידקים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות של נתוני סמנים ביולוגיים נדיפים לאורך שלבי הגילוי והשלבים הפרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר לניתוח חומרים נדיפים מיקרוביאליים בתוכניות מו"פ שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בזיהוי מיקרוביאלי.
- ערך תפעולי: מייעל את תהליכי העבודה באמצעות אנליזה של חומרים נדיפים שהיא מהירה, הדירה וניתנת לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מהירה יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדרי עדיפויות מותאמי סיכון ובקידום של מטרות ובדיקות מיקרוביאליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בספקטרומטריית מסות ובטיפול בתרביות מיקרוביאליות.
- נדרשת גישה למכשור ותשתיות אנליטיות של SESI-MS.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים של פרמטרים מכשירים ותיעוד נתונים.
- ניתן להתאים למיני חיידקים ומצעי גידול שונים, תוך מתן תשומת לב לבקרת זיהומים.
- נקיטת אמצעי בטיחות למכשיר ובטיחות ביולוגית היא חיונית בשל מתח גבוה וגורמים פתוגניים.
