Β-glucuronidase (גאס) נייד מבוסס מוות Assay

המטרה הכללית של הליך זה היא להשתמש במערכת דגימה של Gus כדי לנתח את תכונות המוות הפוטנציאליות של גנים ספציפיים. גנים רלוונטיים משוכפלים לתוך קסטת Gus ומגודלים בווקטורים מתאימים של Agrobacterium תחת פרומוטור 35 s. ווקטורים אלה מועברים לאחר מכן לשבט Agrobacterium, LBA 44 0 4, ומעורבבים עם תרבית המכילה קסטת ביטוי Gus כדי להחדירם לעלי Nick Oceana Hamana.

ניתן להעריך את פעילות ה-Gus באופן ויזואלי באמצעות צביעה היסטוכימית, או באופן כמותי באמצעות בדיקת Fluor metric mug. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון DNA laddering או tunnel assay, הנפוצות במערכות של יונקים אך קשות לשחזור בצמחים, הוא שמדובר בבדיקה זמנית רגישה ומהירה המבוססת על צמחים, המנצלת את העובדה הפשוטה כי תאים חיים נדרשים כדי שביטוי gas יתרחש. הדגמת ההליך היום תתבצע על ידי Hua RAOs.

חוקר פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו. עבור חדירה (Infiltration) נדרשים עלים בריאים ומפותחים במלואם של צמחי nicotiana hamana בני שלושה עד שישה שבועות, שגודלו בטמפרטורה של 25 °C. תכננו לבצע פרוטוקול זה לאורך שמונה ימים. ביום הראשון, בצעו מריחה של מצעים עם מאגרי גליצרול של agrobacterium tumor fassan המכילים את הווקטורים עבור בדיקת מוות התאים ואת הווקטור עם קסטת הביטוי של Gus; כללו תמיד ווקטור ריק כביקורת שלילית או כ-stuffer כאשר נבדקים שילובי תרביות מרובים.

דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 28 °C למשך יומיים. ביום השלישי, זרעו 2 mL של מצע LB סלקטיבי באמצעות קולוניה בודדת מכל צלחית. דגרו כל תרבית בערבול בטמפרטורה של 28 °C למשך 24 שעות במהירות של 200 RPM, עד להגעה לצפיפות גידול מקסימלית.

לאחר 24 שעות של דגירה, השהו מחדש את התרבית באופן מלא באמצעות פיפטור במידה וקיימת התגבשות, והגדילו את הנפח הכולל של כל תרבית ל-10 milliliters של LB סלקטיבי טרי כדי להשרות את הגנים של virulent agrobacterium. הוסיפו אצטון לריכוז של 25 micromolar ודגרו כל תרבית עם ניעור בטמפרטורה של 28 degrees Celsius למשך 16 שעות נוספות. השלב הבא הוא סבוב של כל תרבית בצנטריפוגה במהירות של 4,000 Gs למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, והשהה מחדש של המשקע ב-10 milliliters של מדיום חדירה (infiltration medium).

אל תוסיפו אצטון, סנטריפוגו את התרביות פעם נוספת, אך כעת בצעו Resus. השעיו כל משקע בחמישה מיליליטר של מדיום אינפילטרציה המכיל 100 micromolar אצטון. כעת מדדו את ה-OD ב-600 nanometers.

ריכוזים נמוכים עד 0.1 הם קבילים, אך אם הריכוז גבוה מ-0.9, יש לדלל ל-0.9 עם מצע חדירה ואטון לפני החדירה. דגרו את התרביות פעם נוספת בטמפרטורה של 28 degrees Celsius עם ניעור למשך שלוש שעות לאחר הדגירה. ערבבו את תרביות הניסוי ואת תרביות הביקורת ביחס של אחד ለአחד עם התרבית המכילה את קסית ה-Gus.

עבור כל תרבית, השתמש במזרק ללא מחט של מיליליטר אחד כדי להחדיר את חומר האיטום ABA או לצדיה התחתונים של עלים שצומחים כעת. נפח ההחדרה אינו קריטי. כאשר נוצר אזור של ספיגת מים, פירוש הדבר שנוסף מספיק חומר; החדר את ביקרת השלילה ואת הגן לבדיקה על עלים מנוגדים באותו צמח, ולאחר מכן החדר לשני צמחים נוספים באותה דרך.

לפיכך, קיימים שלושה צמחים חוזרים עבור כל תרבית. שלושה ימים לאחר ההסננה, הגיעה העת לאסוף את העלים ולבצע בדיקה של ביטוי חלבוני הגוסט (gust protein). התחילו את הניתוח ההיסטוכימי על ידי הסננה בוואקום של העלה כולו בתסבכת xlu עד להספגה מלאה.

כעת, הדגרו את העלים בחושך בטמפרטורת החדר למשך הלילה או עד להופעת צביעה כחולה מובחנת. שטפו את העלים במים מזוקקים והדגרו אותם ב-70% ethanol למשך הלילה עד להסרת הכלורופיל. למחרת, שטפו את העלים במים מזוקקים והעריכו את רמות ביטוי ה-GUS.

כדי לכמת את ביטוי ה-Gus, מומר תסבסב mug למוצר פלואורסצנטי mu, אותו ניתן למדוד. התחל בגריסה של דיסקיות עלים שהוחדרו בתוך מכתש באמצעות חנקן נוזלי. לאחר מכן, הוסף 100 µL של בופר מיצוי GUS תוך שמירת הדגימה על קרח. כעת סבב את התוך במהירות של 14,000 ×g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C, ואסוף את העילאי המכיל את כל החלבונים המסיסים, כולל ה-Gus.

מדוד את ריכוז החלבון המסיס הכולל באמצעות NanoDrop והתאם את הריכוז ל-100 micrograms של חלבון כולל עבור כל דגימה בבופר מיצוי Gus. כעת, הוסף סובסטרט mug בבופר מיצוי Gus לכל דגימה עד לריכוז סופי של two millimolar mug. נפח כולל של 100 microliters לדגימה אמור להספיק; ערבב באמצעות פיפטה והדגרה את התגובה למשך שעה ב-37 degrees Celsius.

לאחר שעה, יש לעצור את התגובה על ידי הוספה של 800 µL של תמיסת עצירה ל-GUS. כדי לכמת את ה-GUS, טוענים 100 µL מכל דגימה לתוך פלטת מיקרוטיטר, אשר נסרקת בקורא פלטות פלואורסצנטי; נמדדים אורכי גל של עירור ב-365 nm ופליטה ב-455 nm והתוצאות מושוות לעקומת סטנדרט. ניתן לאחר מכן לדווח על פעילות ה-GUS כ-M של GUS למיקרוגרם של חלבון מסיס כולל לדקת תגובה. רמות GUS שונות מזוהות בהתאם לקונסטרקט שנעשה בו שימוש, כאשר קסטת הביטוי של GUS מוחדרת יחד עם רגולטור שלילי של מוות תאי או גן אנטי-מוות.

בהשוואה זו נצפים רמות Gus גבוהות. רמות ה-Gus בבקרת הווקטור הריק נמוכות הרבה יותר. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש ברגולטור חיובי של מוות תאי או בגן מעודד מוות (pro-death gene), נצפית ירידה ניכרת בביטוי ה-Gus בהשוואה לבקרת הווקטור הריק.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה בתוך כשבוע. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי טכניקה זו משמשת כשלב ראשוני לקביעת הפוטנציאל של גנים ספציפיים. יש לבצע עבודה נוספת כדי לאשר תוצאות ראשוניות אלו ולקבוע את סוג התא המעורב.