ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא להשתמש בשיטה חדשה ומהירה להגברת אות על מנת לזהות ולאפיין תת-סוגים של נגיפי שפעת על גבי ה-flu chip, פלטפורמת מיקרו-מערך (microarray) בצפיפות נמוכה. דבר זה מושג על ידי שילוב של DTPs הביוטיניליים ושימוש בפריימרים בעלי קצה פוספו[]');ל' ב-5' כדי להגביר את מקטע הגן של המטריקס ומקטע גן לא מבני מתוך תמריתי RNA של שפעת. לאחר ה-PCR מתבצעים עיכול אנזימטי ופרגמנטציה כדי ליצור תוצר נגיפי מוגבר וביוטינילילי קצר בעל גדיל בודד, אשר עובר היברידיזציה למערך לאחר תהליך ההיברידיזציה.

גילוי באמצעות Fox משתמש בפוטו-פולימריזציה כדי לגדל נקודות פולימר גדולות שבהן מתרחשת היברידיזציה, ודפוסי היברידיזציה דיפרנציאליים משמשים לזיהוי תתי-סוגים של נגיפי שפעת. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גילוי פלואורסצנציה סטנדרטי, הוא שהיא זולה למדי ומספקת תוצאה מהירה הנראית לעין בלתי מזוינת, עם רגישות אנליטית דומה לזו של פלואורסצנציה. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מאפייני נגיפי שפעת באמצעות שימוש ב-flu chip, מכיוון שהיא מהווה שיטת גילוי אוניברסלית.

ניתן להחיל את Ampl Fox גם על מגוון רחב של מערכות אחרות, כגון מערכי מיקרו (microarrays) אחרים בעלי צפיפות נמוכה המבוססים על DNA וחלבונים. תיאורטית, ניתן לזהות כל תוצר ביוטינילי (biotinylated) באמצעות amox. את הפרוצדורה ידגימו אמבר טיילור (Amber Taylor), מדענית שותפה, וקווין מולטון (Kevin Moulton), עוזר מחקר כאן ב-Endeavor, ששניהם היו דמויות מרכזיות בפיתוח מכשיר ה-Fox ובכימיית הזיהוי במהלך השנים האחרונות.

הפיקו RNA ויראלי מ-200 µL של בידוד ויראלי באמצעות ערכה להפקת RNA ויראלי ובהתאם לפרוטוקול היצרן. אלוטו לנפח סופי של 60 µL ואחסנו את התמציות בטמפרטורה של 70°C- או פחות לשימוש מאוחר יותר. לאחר מכן, הכינו את תערובת ה-RT-PCR על קרח בהתאם לפרוטוקול היצרן.

באמצעות תערובת BIOTINYLATED DNTP, הוסיפו את תערובת הפריימרים של ה-flu chip, המכילה את הריכוזים המוצגים, אל התערובת הראשית (master mix). פריימר אחד מכל סט צריך להכיל קבוצת פוספט בקצה ה-5' כדי להקל על העיכול האנזימטי. סט פריימרים flu a מייצר תוצר של 1032 זוגות בסיסים, וסט פריימרים flu B מייצר תוצר של 811 זוגות בסיסים.

ערבבו קצרות במערבל (vortex) וחלקו 18 µL של תערובת מאסטר (master mix) למבחנות PCR בעיות דופן. לאחר מכן, הוסיפו 2 µL של תבנית RNA לכל מבחנת תגובה. העבירו את מבחנות ה-PCR למחזור תרמי (thermal cycler) והשתמשו בפרופיל מחזורים עם טמפרטורת התאבלה (annealing temperature) מתאימה.

פרופיל המחזורים ששימש במבדק זה מוצג כאן. הכינו את תערובת העיכול האנזימטי על ידי ערבוב של 2.2 µL של חוצן לתגובת האנזים, 0.8 µL של מים נטולי נוקלאז ו-1.0 µL של אנזים lambda exonuclease לכל תגובת PCR. הוציאו את הדגימות מהסייקלר התרמי והוסיפו ארבעה µL לכל מבחנת PCR.

החזירו את הדגימות למחזור התרמי ותכנתו את המכשיר כפי שמוצג ל-37 degrees Celsius למשך 15 דקות, ולאחר מכן ל-95 degrees Celsius למשך 10 דקות. לאחר מכן, מקמו בארי באשורה (hybridization wells) לשימוש חד-פעמי מסביב למערכי המיקרו-מערכים (microarrays) המיועדים להיברידיזציה. לאחר מכן, שטפו את השקופיות ב-110 milliliters של מים מזוקקים על שייקר אורביטלי למשך חמש דקות.

ייבשו את השקופיות על ידי נגיעה עדינה של נייר סופג בקצה הבאר. ערבבו 22 µL של תמיסת היברידיזציה בריכוז 2x עם כל אחד מתוצרי ה-DNA הגדיל בחוט בודד (single strand), ערבבו קצרות והעבירו באמצעות פיפט 40 µL לתוך בארות המיקרו-מערך (microarray). השאירו את השקופיות להיברידיזציה למשך שעה בתוך תא לחות. לאחר ההיברידיזציה, הוציאו את השקופיות מתא הלחות ושטפו קצרות כל שקופית עם 2 mL של תמיסת שטיפה D. הניחו את השקופיות במעמד לשקופיות.

בשלב הבא, הוסיפו 110 milliliters של תמיסות שטיפה A ו-B למכלים נפרדים תוך שימוש במנער אורביטלי. שטפו את מתקן השקופיות בתמיסת שטיפה A במהירות של 60 עד 90 RPM, שהיא המהירות שתשמש לכל השטיפות הבאות, למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוציאו את מתקן השקופיות מתמיסת שטיפה A ושטפו אותו קצרות בתמיסת שטיפה D. העבירו את מתקן השקופיות לתמיסת שטיפה B ושטפו במנער האורביטלי למשך חמש דקות.

לאחר השטיפה, ייבשו בעדינות את המערכים על כל שקופית בעזרת נייר ניגוב והניחו את השקופיות המיובשות בתא לחות. כהכנה לשלבי הגילוי kolor metric של fox, ערבבו 10 µl של amplitude, 20 µl של two x amplitude buffer ו-10 µl של מים מזוקקים עבור כל מערך המיועד לעיבוד; העבירו 40 µl מתערובת הסימון לכל מערך ואפשרו לתגובת הסימון להתבצע בתא לחות סגור למשך חמש דקות. במהלך ההיברידיזציה, הכינו 110 mL של wash buffer C במכל. לאחר הסימון, שטפו מיד כל מערך בעזרת wash buffer D. הניחו כל שקופית במעמד לשקופיות ושטפו ב-wash buffer C על שייקר אורביטלי למשך חמש דקות; לאחר השטיפה ב-buffer C, טבלו את מעמד השקופיות שלוש פעמים למשך זמן קצר במכל של מים מזוקקים.

להסרת שאריות מלח, ייבשו את המערכים כפי שהודגם קודם לכן. אחסנו את המערכים בתיבת סליידים חשוכה עד להפעלה פוטו-כימית ולדימות, אשר צריכים להסתיים בתוך 24 שעות. לאחר מכן, הדליקו את קורא ה-Amli Fox וודאו שתוכנת ה-Amli view מוכנה להפעלה פוטו-כימית לפני זיהוי דגימת המערך.

ראשית, קבעו את זמן הפעלה הפוטו-אופטית האופטימלי עבור כל הדגימות באמצעות ביצוע הליך כיול קצר. פעם אחת בכל יום שימוש, חממו את תמיסת ה-Amplify לטמפרטורת החדר וערבבו קצרות באמצעות וורטקס; העבירו באמצעות פיפטה 3 µL של amplify enhancer אל מבחנת ה-amplify וערבבו היטב בוורטקס. למשך 10 שניות, מרחו באופן אחיד 40 µL של תמיסת Amplify על שקופית אחת בלבד בכל פעם, תוך וידוא שאין בועות.

הכנס את שקופית המיקרו-מערך (microarray) לתא הפוטו-אקטיבציה של ה-Amplify Reader. התחל את הפוטו-אקטיבציה על ידי בחירה ב-start בתוכנת ה-PL view, תוך שימוש בזמן הפוטו-אקטיבציה שנקבע בתהליך הכיול. עם הסיום, שטוף את המיקרו-מערך עם 2 mL של מים מזוקקים כדי להסיר עודפים; כעת התרחשה התגבשות של פולימר amplify clear בנקודות המכילות את ה-DNA מטרה, אך היא תהיה גלויה יותר.

לאחר הצביעה, יש להמתין שתי דקות לייבוש נקודות הפולימר. לאחר מכן, יש להטיל שתי טיפות של amply red על המערך ולהמתין שתי דקות להשלמת הצביעה. בסיום הצביעה, יש לשטוף במהירות את השקופית במים מומחרים ולייבשה כפי שהודגם קודם לכן. יש להכניס את השקופית לתא ההדמיה של קורא ה-Amli Fox כדי לצלם תמונה ולהשתמש בתוכנת amli לעיבוד התוצאות. התמונה השמאלית מראה זיהוי של דגימת H one N one חדשה משנת 2009 באמצעות Amli Fox.

בעוד שהתמונה מימין משתמשת בפלואורסצנציה מסורתית שנוצרה על ידי סורק מיקרו-מערך פלואורסצנטי קונפוקאלי, ניתן לראות בקלות את אותה תבנית זיהוי כללית בשתי השיטות. עם זאת, תוצאת ה-Amli fox גלויה לעין בלתי מזוינת. תמונות אלו מציגות תוצאות של שבב פלואורסצנטי ממקור אנושי, H3N2 ממקור אנושי, H1N1 ממקור חזירים, H1N1, ומערך fox שלילי ללא שפעת ניתנת לגילוי.

רצפים שתיים ושלוש המסומנים בכחול מייצרים אות עבור כל תתי-הסוגים של השפעת המוצגים, אך הרצפים המסומנים באדום בפינה הימנית התחתונה מייצרים אות רק עבור הדגימה ממקור חזيري, H1N1. הדגימה השלילית מראה אות ברצף בקרה פנימי המסומן בירוק, מה שמעיד על היעדר עיכוב או כשל בתגובת ה-RT-PCR.

לאחר השליטה בתהליך, ניתן לבצע את הפרוצדורה כולה, מההפקה מהמבחנה דרך זיהוי amox ועד לפירוש התוצאה הסופית, תוך כשש שעות. חלקו של זיהוי ה-Ampl Fox בפרוצדורה, כולל כיול המכשיר, יכול להסתיים תוך כ-30 דקות לאחר ביצוע שלב זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון ריצוף חלקי או מלא של הגנום, כדי לענות על שאלות נוספות.

בדיקת שפעת זו מיועדת כסינון ראשוני, במיוחד עבור דגימות שתוצאתן היא תבנית היברידיזציה ייחודית. מכיוון שהזיהוי הוא בדיקה כללית, אנו מקווים שחוקרים ימצאו יישומים חדשים ומעניינים למערכי מיקרו-מערך (microarray) בצפיפות נמוכה, שבהם הזיהוי יוכל להוסיף ערך.