הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

תחזוקה של רקמות אפיתליאליות דורשת הסרה רציפה של תאים פגומים ומתים מבלי לפגוע בתפקוד המחסום. כדי להשיג זאת, תאים אפיתליאליים דוחפים החוצה תאים גוססים על ידי יצירה וכיווץ של טבעת אקטין ומיוזין בתא המקיף את התא הגוסס, כדי להשליכו תוך סגירת כל הפערים שעלולים להיווצר כתוצאה מיציאתו. במאמר וידאו זה, מוצגת שיטה להשראה ולדימוי של דחיקה של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג זברה בזמן אמת.

במקרה המוצג, הדבר מושג על ידי הזרקה של גשש F actin המסומן בחלבון פלואורסצנטי אדום לתוך שלב תא אחד של עוברי דגי zebrafish טרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק באפידרמיס, כדי להמחיש את סיבי האקטין ברקמות אפיתליאליות. זחלים ביום הרביעי לאחר ההפריה, המבטאים הן GFP והן RFP, מטופלים לאחר מכן ב-G418 כדי להשרות אפופטוזה באפידרמיס. דינמיקת האקטין ושינויי הצורה של התאים האפיתליאליים המתרחשים במהלך ההדחקה (extrusion) מומחשים באמצעות דימות time-lapse במיקרוסקופ קונפוקאלי בעל דיסק מסתובב.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונו-כוח ואנליזות, הוא היכולת לצפות בשינויים מהירים ובדינמיקה של actin המתרחשים במהלך תהליך האקסטרוזיה ברקמה אפיתליאלית חיה. בסרטון זה, נדגים הליך לדימוי של אקסטרוזיה של תאים אפופטוטיים מהדרמיס של דגי זברה בשלבי התפתחות בזמן אמת. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי להבין כיצד תאים מסדרים מחדש באופן מתואם את שלד התא של ה-actin כדי להסיר תאים אפופטוטיים תוך שמירה על תפקוד מחסום, וכיצד שיבוש של תהליך האקסטרוזיה עשוי להוביל למצבים מחלות מסוימים.

כדי להתחיל, לצורך ויזואליזציה של דינמיקת האקטין במהלך דחיסה תאית (cell extrusion) באפידרמיס של דגי זברה (zebrafish) מתפתחים, התחילו בהפשרה של RNA שתומלל בעבר על קרח. אנו מתמללים mRNA המקודד לחלבון פלואורסצנטי אדום המחובר לדומיין ההומולוגיה של calponin של utrophin ולחלבון קושר אקטין. הוסיפו phenol red ל-RNA ביחס של 1:1 לריכוז RNA סופי של כ-30 ng/µL, וטענו 1 µL מהתמיסה לתוך מחט קפילרית שנמשכה באמצעות מילוי אחורי (back filling).

אספו כ-75 עוברים של C-K-G-F-P בשלב תא אחד לתוך תמיסת E three. העבירו באמצעות פיפטה את העוברים שנאספו לתבנית המיקרו-הזרקה באמצעות פיפטה רחבה של 5.75, וכוונו בעדינות את העוברים בתוך התעלה בעזרת פינצטת Dumont מספר 5. עבדו במהירות כדי להימנע מהזרקת RNA לעוברים בשלבים מתקדמים, תחת מיקרוסקופ סטריאו למחקר מעבדה סטנדרטי.

השתמשו במיקרו-מזרק בעל בקרת לחץ כדי להזריק את ה-RNA לחלמון של העוברים כפי שסומן בפנול. הצבע האדום צריך להיות גלוי בעובר לאחר ההזרקה. הקפידו להזריק לפחות ל-50 עוברים עבור כל ניסוי.

מיינו את העוברים כדי להסיר ביצים לא מופרות או פגומות, והדגרירו את כל שאר העוברים בטמפרטורה של 28 °C. לאחר 24 שעות, השתמשו במיקרוסקופ דיססקציה פלואורסצנטי כדי לבחור עוברי zebrafish בעלי רמה גבוהה של פלואורסצנציית GFP באפידרמיס ופלואורסצנציית RFP מסומנת. הדגרירו את העוברים שנבחרו בטמפרטורה של 28 °C עד להגעה לשלב הטיפול התרופתי להשראת אפופטוזיס באמצעות חשיפה לאמינו גליקוזיד.

האנטיביוטיקה G 418 או התרופה גורמות לדחיקה החוצה של תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי zebrafish מתפתחים. חשוב לציין כי טיפול זה יעיל רק בזחלים שנמצאים ביום הרביעי לאחר ההפריה ומעלה כדי להשרות דחיקה של תאים. אספו עד 25 זחלי zebrafish ביום הרביעי לאחר ההפריה המבטאים הן GFP והן RFP אל תוך צלחת תרבית של 35 על 10 מילימטר המכילה שלושה מיליליטר של מצע E3.

החליפו בזהירות את המצע בשלושה מיליליטר של E three המכיל 1 mg/mL של G four 18, והדגירו את הזחלים בתרופה למשך ארבע שעות בחושך בטמפרטורה של 28 °C. לאחר מכן, הסירו את המצע והחליפו אותו במצע E three שחומם מראש ומכיל 0.02% trica, והמשיכו להרכבת הזחלים לצורך הדמיה. העבירו עד שלושה זחלים לפח ל-1.5 מיליליטר והסירו את רוב מצע ה-E three.

בעזרת טיפ של פיפט חתוך, העבירו 120 µL של 1% low melt agarose אל תוך המבחנה וערבבו. לאחר מכן, העבירו בעדינות בעזרת פיפט את הזחלים ותערובת ה-agarose על גבי זכוכית כיסוי בתחתית של צלחת תרבית matech. בעזרת מחזיק פינים FST עם פין מוכנס או מחט טונגסטן מחוברת, יישרו במהירות את הזחלים כך שיהיו ישרים ומוצמדים לזכוכית הכיסוי.

המתינו עד שהג'ל יתגבש. לאחר מכן, מלאו בעדינות את הכלי בתווך E3 המכיל 0.02% trica. מצאנו כי התהליך השלם של פליטת תאים אפופטוטיים מהאפידרמיס של זחלי דג זברא בשלבי התפתחות אורך כ-20 דקות.

כאן אנו מדגימים כיצד להגדיר ניסוי דימות בשיטת צילום רצף זמנים (time-lapse) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי עם דיסקה מסתובבת ותוכנת and or IQ, כדי לאסוף סדרה של מישורי Z דרך שכבה בודדת של האפידרמיס של דג הזברה. ראשית, הפעילו את לייזרי הארגון והליום-ניאון, את מצלמת המיקרוסקופ ואת מנורת הפלואורסצנציה האפי-פלואורסצנטית בתוך תוכנת and or IQ. צרו פרוטוקול של סדרת זמנים הכולל את אורכי הגל שיוצגו בדימות.

תדירות המרווחים בין לכידות התמונה ומספר הפעמים שבהן יש לחזור על הלכידה. הניחו בעדינות את צלח ה-mattec המכיל את הדגימה על בסיס המיקרוסקופ, ולאחר מכן השתמשו בעדשה עם הגברה של 20 פעמים ובאור תמיכה (transmitted light) כדי להתמקד בזחלים. העבירו את עדשת הטבילה במים עם הגברה של 40 פעמים למצב הנכון. באמצעות עדשה זו, ניתן להקליט בערך 20 עד 25 תאים לשדה, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר התנהגויות תאיות במהלך תהליך ה-extrusion, תוך הגעה לרזולוציה המאפשרת צפייה בדינמיקה תת-תאית של actin.

הנח בזהירות טיפת מים על חלקו העליון של העדשה אובייקטיבית פי 40 והנח במהירות את צלח ה-mattec מעליה. זהה את הדגימה באמצעות תאורת שדה בהיר (brightfield), ולאחר מכן השתמש בפלואורסצנציית epi באורך גל של 488 ננומטר כדי להתמקד ספציפית באפידרמיס החיובי ל-GFP. עבור למצב סריקה קונפוקאלית.

כוון את עוצמת הלייזר ואת זמן החשיפה עבור כל אחד מהערוצים בהתאם. הקפד לאזן בין הספק הלייזר לזמן החשיפה כדי להגיע לגילוי אופטימלי של האות וכדי למנוע פוטו-טוקסיות. כדי לזהות תאים בולטים (extruding cells), השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית מסוג epi כדי להוות ויזואליזציה של האפידרמיס המסומן ב-GFP, וזהה קבוצת תאים בתבנית רוזטה קלאסית, המורכבת מאוסף תאים המקיפים תא עגול קטן במרכז.

בנוסף, צריכה להיות נראית הצטברות של אקטין המסומן ב-RFP כטבעת סביב התא העגול הקטן שבמרכז, סימן היכר של דחיקת תאים (cell extrusion). לאחר זיהוי תא שנדחק, הגדירו במהירות את הגבולות העליונים והתחתונים עבור ה-Z Series ואת גודל הצעד. לאחר מכן, התחילו ברכישת ארבעה מערכי נתונים של D confocal כדי לבחון את הנתונים ולהמחיש את התכווצות טבעת האקטין ואת ההתנהגויות האפיתליאליות המתרחשות סביב התא הגסס.

במהלך הזמן, צור היטלי תלת-ממד (3D projections) של סדרת ה-Z ושמור את הנתונים כקובץ סרטון. ניתן לבצע שלב זה באמצעות מגוון חבילות תוכנה. דמות זו מראה את הביטוי של RFP UTR CH באפידרמיס של זחלי דג זברה CK GFP ארבעה ימים לאחר ההפריה.

להלן תמונות סטילס של היטל Z (Z projections) מסרט time lapse העוקב אחר דינמיקה חיה. במהלך תהליך של פליטת תאי אפיתל (epithelial cell extrusion), החצים מצביעים על טבעת האקטין שנוצרת על ידי תאים שכנים, אשר מתכווצת ונסגרת במהלך של שתי דקות. לאחר הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות בשילוב עם טכניקה זו, כגון שימוש במעכבים כימיים או במוטציות גנטיות, כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים בתהליך הפליטה עשויים להוביל למצבים מחלה מסוימים.

בהתבסס על הכישלון בפינוי תאים אפופטוטיים, הראינו לכם כיצד להקים ניסוי של דימוי במרווחי זמן (time-lapse imaging) כדי להמחיש את תהליך הדחיקה מהאפידרמיס של דג זבראם בשלבי התפתחות. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להגביל את כמות האור החושפת את הדגימה כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photo bleaching) או רעילות. וזהו הכל.

תודה לצפייה ובהצלחה בניסוייכם.