אפיון מבודד, מאוורר ריאות, instrumented ועכבר perfused עם תזרים pulsatile
29 באפריל 2011
פרוטוקול הבא מתאר את התהליך של בידוד, איוורור ו instrumenting הריאות העכבר כדי למדוד יציב או pulsatile לחץ הדם הריאתי זרימה יחסים כדי לכמת את ההשפעות של זרימת הדם, זרימת אוויר, שינויים בדרכי הנשימה ושינויים בכלי הדם על afterload חדרית הנכון.
לבדיקת קשרי זרימה של לחץ ריאתי פולסטילי. פרוטוקול זה מסביר כיצד לבודד, להנשים ולבצע פרפוזיה לריאות של עכבר. הקנה נחשף בניתוח לצורך הנשמה.
לאחר מכן מבודדים את הלב והריאות כדי שניתן יהיה לבצע קנולציה לעורק הריאתי ולשליא השמאלית. לאחר מכן מבצעים פרפוזיה למערכת הריאתית. הניסויים מבוצעים על ידי שינוי של הזרימה בעורק הריאתי, עוצמתה, צורת הגל שלה ו/או התדירות שלה.
צורות גלי הלחץ המתקבלות בעורק הריאתי ובעליה השמאלית נרשמות ומדגימות את קשרי זרימת הלחץ הפולסטיליים בריאות. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תכשירים in vivo, הוא שניתן להשיג קשרי זרימת לחץ פולסטיליים ללא שינויים במצב הנפח, בטון של מערכת העצבים הסימפתטית, בפעילות ובשפעות ההרדמה.
בנוסף, רוב תכונות הריאות המבודדות מודדות רק קשרי זרימה-לחץ קבועים, בעוד שהטכניקה שלנו מאפשרת לקבוע קשרי זרימה-לחץ פולסטיליים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הפיזיולוגיה הריאתית, כגון כיצד מחלה וסקולרית ריאתית משפיעה על המודינמיקה הריאתית הפולסטילית, או כיצד הקשחה של העורק הריאתי הגדול משפיעה על העומס לאחר-טעינה של החדר הימני? הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן חשיפת הלב והריאות וקיבוע הקנולה בעורק הריאתי הם שלבים שקשה ללמוד.
לחץ עודף ממכשירי המדידה עלול לגרום לבבקה בריאות, ומיקום שגוי של הקניולה עלול לגרום לנקב בעורק הריאה. לפני תחילת הניסוי, יש להכין את מערכת ה-IL one המשמשת להנשמה ולפרפוזיה של הריאה המבודדת. יש לחבר את הצינורות לממירים הלחציים.
השתמש במשאבה אחת ובמד זרימה כדי לשטוף לחלוטין את המערכת במים מזוקקים המחוממים ל-37 °C, והסר בועות אוויר מהצינורות. לאחר מכן, בצע ה priming לצינורות המשאבה של ה-Endur tech באמצעות 1%PBS. כעת בצע איפוס (zero).
מדדו את הלחץ עבור כל מתמר P 75 תחילה על ידי סגירת השסתום שלו למערכת ה-IL one ופתיחת השסתום שלו לאטמוספירה. לאחר מכן, השתמשו במגבר ה-SIS plug כדי לאפס את הלחץ באופן אוטומטי. לפני הכנת בעל החיים, לחחו את מערכת ה-IO one על ידי השריה של פיסת הקרמיקה הנקבובית במים מזוקקים. לאחר הרדמת העכבר, ייצבו את העכבר לניתוח על ידי קיבוע כפות רגליו הקדמיות ללוח שעם.
כעת רסס את החזה ב-95% alcohol. השתמש בפינצטה ישרה כדי לתפוס את העור באזור הצוואר וגזור פתח של סנטימטר אחד באמצעות המספריים הישרים. לאחר חשיפת החלק הפנימי של הצוואר, הסר רקמה בלוטית לבנה בשרירים השטחיים תוך חיפוש אחר הוושט והקנה.
בודד את הוושראות ואת קנה הנשימה מהרקמות משני הצדדים ומאחור, וקשור תפר רפוי מסביב לקנה הנשימה. כדי לבצע קניולציה של קנה הנשימה, גזור בזהירות חריץ קטן בצורת V באחד מצדדיו בעזרת המספריים הקטנים. כעת העבר את העכבר למערכת ה-IL one באמצעות פינצטה קהה.
קחו את הקניולה הקנה והחליקו אותה לתוך הקנה. הדקו את הקניולה באמצעות תפר. התחילו את ההנשמה תחילה באוויר חדר, רססו את החזה באלכוהול והסירו את העור באמצעות פינצטה ישרה ומספריים ישרים.
גזרו את העור כלפי מעלה לאורך עצם הסטרנום (sternum). הרימו את העור בכל צד וגזרו לאורך קו הצלעות התחתונות. כעת אחזו בתהליך הזיפואיד (xiphoid process) בעזרת פינצטה והשתמשו במספריים בעלי קצה כדורי כדי לגזור חור בסרעפת בנקודת המפגש שלה עם חלקו התחתון של הסטרנום.
תפסו את הסרעפת וגזרו אותה מהצלעות. באמצעות מספריים בעלי קצה כדורי, תפסו שוב את התהליך החרב (xiphoid process) והשתמשו במספריים בעלי הקצה הכדורי כדי לגזור בזהירות את עצם החזה כלפי מעלה דרך הצלעות, תוך הקפדה לא לפגוע בריאות, בלב או בכלי הדם. כדי לחשוף את הלב, תפסו את הצלעות השמאליות וגזרו את קצותיהן.
כעת הזרקו באיטיות לחדר הימני 0.1 milliliters של heparin. לאחר ההזרקה, גזרו את שאר הצלעות. השתמשו בחלק האחורי או בקצה המעוגל של הפינצטה כדי לדחף בעדינות את הריאות הרחק מהצלע בזמן גזירת הצלעות תחת מיקרוסקופ. הסירו רקמה בלוטית מהשומן שמעל הלב.
השתמשו בפינצטה כדי להרחיק את הרקמות וגזרו אותן. כדי להניח תפר סביב האורטה ועורק הריאה באמצעות מספרי קפיץ, הרימו בעדינות את הלב בעזרת פינצטה קהה. לא אמורה להיות התנגדות רבה.
כעת קשרו תפר רפוי באמצעות קשירה כפולה. לאחר מכן, גזרו את הבטן התחתונה. השתמשו במספריים זוויתיים כדי לגזור דרך הצלעות ועמוד השדרה.
פעולה זו תגרום לזרימה משמעותית של דם. השתמשו במקלון צמר גפן (Q-tip) כדי לעצור את הזרימה. לאחר שהזרימה של הדם פסקה, הכינו (prime) את מערכת ה-IL באמצעות ארבעה מיליליטרים של RPMI ממזרק מלא ב-10 מיליליטרים של RPMI.
מומלץ לוודא שאין בועות בתוך הפיתול. כעת בצעו קניולציה של החדר הימני על ידי חיתוך חריץ קטן ליד השיא (apex) והחדרת הקניולה. כוונו כלפי מטה אל תוך החדר הימני כדי להגיע לעורק הריאתי. קצה הגשש צריך להיות נראה דרך הדופן השקופה למדי של העורק הריאתי.
לאחר מכן, הדק את התפר סביב הקנולה, האורטה והעורק הריאתי כדי לבצע קנולציה של החדר השמאלי. חתוך חריץ בשיא הלב (apex) והכנס את הקנולה בכיוון מעלה לעבר העליה השמאלית. ייתכן שיהיה צורך במעט לחץ כדי למצוא את המסתם, אך ברגע שיימצא, הקנולה תחליק פנימה ותישאריציבה ללא צורך בתפר.
הזרם ידנית RPMI ממזרק ה-10 milliliter בקצב של 0.3 milliliters לדקה עד שתראה זרימה בצינור המוצא. אם אין זרימה בצינור המוצא, מנח מחדש את קנולת החדר השמאלי. עם זאת, אם אין זרימה בריאות, הפסק את הניסוי מכיוון שסביר להניח שיש דליפה בעורק הריאתי.
כעת, לאחר שהלב קנולירט במלואו, חברו את המזרק בנפח 60 מיליליטר למערכת ה-IL one. השתמשו במשאבת זרימה קבועה והזרים את ה-RPMI Perfuse eight בקצב של 1 מיליליטר לדקה. בדקו אם קיימות דליפות במהלך הפרפוזיה הראשונית.
בצעו פרפוזיה הדרגתית של הריאות למשך שתי דקות נוספות, במהלכן הריאות יהפכו ללבנות. עבור מחקרי זרימה פועמת (pulsatile flow), הגדירו תחילה את מעתק הבוכנה של המשאבה הבודדת לרמות הרצויות.
לאחר מכן הגדירו את קצב הזרימה הקבוע. כעת פתחו את השסתום למשאבת ה-osli והתחילו להקליט נתונים רגע לפני הרצת פרופיל הזרימה של ה-osli. עם הסיום, פתחו את קובץ פלט הנתונים ושרטטו את הזרימה הניסויית בהתבסס על הזרימות הניסוייות מהניסוי הראשוני.
כווננו את תזוזת בוכנת משאבת התנודה בכל תדר כך ש-Q max יהיה לפי הרצוי. שמרו על אוורור בלחץ קבוע. במהלך איסוף נתונים עבור ניסויי זרימה רציפה, סגרו את השסתום למשאבה הבודדת והגדירו את קצב הזרימה הרציפה לרמה הרצויה. התחילו בהקלטת נתונים ועברו דרך פרוטוקול הזרימה הרציפה.
איסוף נתונים למשך 10 שניות לפחות בכל קצב זרימה בין הניסויים. הגדירו מחדש את קצב הזרימה ל-0.5 milliliters per minute. הקפידו לשמור על לחץ אוורור קבוע במהלך איסוף הנתונים.
אם ברצונכם לבצע ניסויים שבהם לחץ העליה השמאלית הוא אפס, הסירו את צינור הניקוז בזמן ביצוע הניסויים. עקבו בדריכות אחר הגעת RPMI לצינורות נתיבי הנשימה. אין לאפשר ל-RPMI להגיע למתמירים של לחץ נתיבי הנשימה, שכן הדבר יגרום לנזק להם.
להלן תוצאות של פרפוזיה בזרימה קבועה, כאשר השורה העליונה מציגה את ספיקת הזרימה Q והשורה השנייה מציגה את לחצי העורק הריאתי והעלייה השמאלית תחת תנאים שונים. בשני הפאנלים הראשונים, הלחץ בעלייה השמאלית עלה וירד בהתאם ל-Q מכיוון שצינור המוצא היה במקומו; הפאנל הראשון מראה לחץ אוויר בסוף נשיפה, לחץ שאיפה, והשני מראה לחץ אוויר בסוף נשיפה. לאחר מכן, הוסר הצינור כך שהלחץ בעלייה השמאלית היה קבוע ובלתי תלוי ב-Q. לאחר מכן, גובה צינור המוצא הותאם ידנית כך שהלחץ בעלייה השמאלית היה גבוה יותר.
אך ללא קשר ל-Q שוב, הפנל הראשון מציג לחץ אוויר בסוף נשימה, לחץ שאיפה, והשני מציג לחץ אוויר בסוף נשיפה. את קשרי זרימת לחץ העורק הריאתי היציבים שמתקבלים לכל מקרה ניתן להשיג על ידי שרטוט הלחץ לעומת הזרימה.
להלן תוצאות הפרפוזיה בזרימה פולסטילית, כאשר ספיקת הזרימה Q מוצגת בלוח העליון, ובלוח התחתון מוצגים הלחצים הנובעים מכך בעורק הריאה, בעלייה השמאלית ובאוויר. מיחסי זרימה ולחץ פולסטיליים אלו בעורקי הריאה, ניתן לחשב את העכבה הווסקולרית הריאתית, המשקפת את סך העומס שלאחר התכווצות (afterload) של החדר הימני.
לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך 20 עד 30 דקות. במהלך ביצוע הפרוצדורה, חשוב להקדיש את הזמן הדרוש ולהרגיש נינוח כדי להבטיח ידיים יציבות. ברגע שהריאות מופרסות כראוי, החלק הקשה מסתיים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע טכניקות נוספות כגון היסטולוגיה או בדיקות ביוכימיות ברקמת הריאה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו מנגנונים מולקולריים אחראים לשינויים שנצפו ביחסי זרימת הלחץ הפולסטילי הריאתי. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הפיזיולוגיה הריאתית לבחון את תפקידם של גנים וחלבונים ספציפיים בהתפתחות ובהחמרה של מחלות וסקולריות ריאתיות באמצעות שימוש בעכברים שעברו שינוי גנטי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מסביר את תהליך הבידוד, ההאוורור והפרפוזיה של ריאות עכבר לצורך חקר יחסי זרימה-לחץ ריאתיים פולסטיליים. מטרתו היא לכמת את ההשפעות של גורמים שונים על העומס לאחר-סיסטולי (afterload) של החדר הימני.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- פיזיולוגיה ריאתית
- מחקר קרדיווסקולרי
- ביולוגיה ניסויית
רקע
- הבנת מערכות היחסים בין לחץ לזרימה בכלי הדם הריאתיים היא קריטית לבריאות הלב וכלי הדם.
- בידוד ריאות עכבר מאפשר ביצוע ניסויים מבוקרים.
- העומס שאחרי התכווצות (afterload) של החדר הימני מושפע מזרימת הדם ומשינויים בדרכי הנשימה.
- לימוד מערכות יחסים אלו יכול לספק תובנות לגבי מחלות ריאה.
מטרת המחקר
- למדידת קשרי לחץ-זרימה כליים ריאתיים במצב יציב ובמצב פולסטילי.
- לכימות השפעות זרימת הדם וזרימת האוויר על העומס לאחר-טעינה (afterload) של החדר הימני.
- לבחינת ההשפעה של שינויים וסקולריים על התפקוד הריאתי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ריאות עכבר באמצעות חשיפה כירורגית של הקנה.
- הנשמה ופרפוזיה של מערכת הריאות.
- קנולציה של העורק הריאתי והעליה השמאלית.
- מניפולציה ניסיונית של זרימת העורק הריאתי ושל צורת הגל.
תוצאות עיקריות
- ביסוס פרוטוקול למדידת קשרי לחץ-זרימה ריאתיים.
- הדגמה של האופן שבו שינויים בזרימה משפיעים על העומס שאחרי (afterload) של החדר הימני.
- תובנות לגבי הדינמיקה של ההתנגדות הווסקולרית הריאתית.
- השלכות פוטנציאליות להבנתיתלחץ דם ריאתי (pulmonary hypertension).
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר המודינמיקה הריאתית.
- הממצאים תורמים להבנת הפיזיולוגיה של מערכת القلب וכלי הדם.
- מחקרים נוספים יכולים לבחון התערבויות טיפוליות למצבים ריאתיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון כמותי של התנגדות וכבלי העמידה (impedance) של כלי הדם הרשמיים בריאות עכבר מבודדות ומאווררות מאפשר הפחתת סיכונים מדויקת של מנגנוני העומס לאחר-טעינה (afterload) של החדר הימני במודלים פרה-קליניים. גישה זו מספקת בקרה עצמאית על משתנים פיזיולוגיים מרכזיים, ובכך תומכת בתיקוף יעדים ברמת ביטחון גבוהה ובבדיקה מנגנונית של מחלות כלי דם ריאתיים. יכולתה של השיטה להבחין בין תרומות של כלי דם פרוקסימליים לדיסטליים תומכת ברציפות תרגומית (translational continuity) מהפרעה מולקולרית ועד לתוצאות המודינמיות תפקודיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה קפדנית של היפותזות טיפוליות הנוגעות למערכות היחסים בין המבנה לתפקוד של כלי הדם הריאתיים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי בידוד ההשפעות של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות על העכבה וההתנגדות הווסקולרית.
- מסייע בתיקוף תפקודי של יעדים על ידי כימות העומס שאחרי (afterload) של החדר הימני בתגובה לפגמים ברמה המולקולרית.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת ex vivo מןוולידציה למדידה הדירה של מדדי לחץ-זרימה ועכבה.
- מסטנדרטיז פלטיים כמותיים כגון Z0, ZC, ו-RW לצורך סריקה השוואתית של תרכובות או גנים.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של פעולות ספציפיות לאתר של חומרים וזוואקטיביים בתוך כלי הדם הריאתיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מדדי המודינמיקה פרה-קליניים למדדים רלוונטיים קלינית של עומס לאחר (afterload) בחדר הימני.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור הפרעות מולקולריות לתוצאות כלי דם פונקציונליות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוססות על תוצאות המודינמיות ניבויות במודלים רלוונטיים למחלה.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פלטפורמה לבדיקת השערות, הפחתת סיכונים מכניסטיים והערכה כמותית של תפקוד כלי הדם הריאתיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבידוד של משתנים בלתי תלויים כדי להבהיר תרומות של מסלולים לעכבה והתנגדות וסקולרית.
- סריקה: מספק פלטיים המודינמיים כמותיים וניתנים לשחזור להשוואה בין תנאים שונים ובין תרכובות שונות.
- אנליטיקה: מאפשר חישוב של עקומות לחץ-זרימה מרובות נקודות ומדדי עכבה תלויי-תדירות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות למדידות של עומס לאחר בחדר הימני בעלות רלוונטיות קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשימוש חוזר להערכה פונקציונלית של כלי הדם בריאות לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות ואת ההבנה המכניסטית של מחלות כלי דם ריאתיים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה של בדיקות המודינמיות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) באמצעות אספקת נקודות קצה כמותיות ורובסטיות למיון פורטפוליו.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ותרכובות בהתאם לסיכון, על בסיס תוצאות וסקולריות פונקציונליות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות של בידוד ריאות וקנולציה במיקרו-כירורגיה.
- נדרש מיכשור מדויק למדידת לחץ, זרימה ועכבה (אימפדנס).
- נדרש סטנדרזציה קפדנית בין הצוותים של פרמטרי פרפוזיה ואוורור.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור הבדלים אנטומיים.
- טיפול זהיר חיוני כדי למנוע ארטיפקטים כגון בצקת או נקב בכלי דם במהלך ההקמה.
