ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להעריך את יכולת תיקון הממברנה הן בבעל החיים והן בתאים מבודדים. סיבי שריר שלד מבודדים נאספים ומוקפים במצע המכיל צבע FM 1 43. לאחר מכן נעשה שימוש בלייזר UV כדי להקרין ולפגוע בחלק מממברנת התא כדי לאפשר חדירה של הצבע אל התא.

תאים מבודדים עוברים טרנספקציה עם פלסמיד DNA המבטא GFP MG 53, אשר ימוקם בממברנה הפלסמטית ובציטוזול של התא. לאחר מכן, קצה של מיקרו-אלקטרודה מוחדר לממברנת C two C 12 כדי לגרום לנזק. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות טרנסלוקציה של GFP MG 53 לאתר הפגיעה.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן נדרש תרגול כדי לשלוט בטכניקות של חדירת מיקרו-אלקטרודה ובידוד סיבי שריר. את הפרוצדורה ידגימו ד"ר Lin, מנהל המעבדה שלנו, ד"ר Wazu, פוסט-דוקטורנט Matt Orange, סטודנט לתואר מתקדם, וד"ר Shaza, מרצה בכירה למחקר במחלקה שלנו. כדי להתחיל, הניחו מגש או משטח מעבדה כחול מתחת להליכה כדי לאסוף פסולת מהבעלי החיים במהלך הניסוי.

בשלב הבא, הגדירו את זווית משטח מסוע הריצה. בחלק ממסועי הריצה קיים מנגנון מובנה לכיוון השיפוע, בעוד שבמסועים אחרים יש להגביה את המסוע באמצעים אחרים. בדרך כלל נעשה שימוש במשטח שטוח או בזווית שבין 7 ל-15 מעלות במורד או בעלייה.

הסגילו את העכברים על ידי הנחתם על המסוע כאשר רשת החשמל כבויה ומנוע הנעת הרצועה פועל, אך ללא תנועה, למשך 15 דקות. לאחר תקופת ההסגילה, הפעילו את רשת החשמל המוטיבציונית. התחילו את פעולת המסוע במהירות ראשונית של כחמישה מטרים לדקה. הגבירו את המהירות במטר אחד עד שניים לדקה בכל דקה, ואפשרו לבעל החיים תקופת חימום של חמש דקות.

חזור על תקופת חימום זו מדי יום במשך 3 עד 10 ימים כדי להגביר את רמת הציות במהלך הבדיקה. לביצוע תרגיל תשימה אקוטי, הגבר את מהירות מסוע הריצה לאורך זמן עד להגעה למהירות מקסימלית, ועקוב אחר סימני תשישות.

בעל חיים נחשב לתשוש כאשר הוא מבלה יותר ממחצית מהזמן מחוץ להליכון או חמישה שניות רצופות על הסבכה. הוצא את העכבר התשוש ורשום את סך זמן הריצה. אימון סיבולת.

פרוטוקולי ריצה מתחילים באותו הליך חימום. עם זאת, המהירות המקסימלית היא בדרך כלל נמוכה יותר וזמני הריצה עשויים להיות ארוכים למדי. החזירו את העכברים לכלוב הבית לאחר הבדיקה ונקו את מסע הריצה ב-70% ethanol.

בודד את השכבה השטחית של שריר ה-flexor digitorum brevis מכף הרגל לצורך ניתוח נוסף. ראשית, חתוך את עור כף הרגל בקו האמצע, תוך הקפדה לא לפגוע בשריר שמתחתיו. לאחר מכן, בצע חתכים אופקיים והסר את העור.

זהו את הגיד הלבן והשטוח של שריר ה-FDB המחובר לעצם העקב (calcaneus). השתמשו בפינצטה כדי להפריד ולאחר מכן לחתוך את הגיד בקרבת נקודת ההיצמדות. משכו את הגיד למעלה בעדינות תוך חיתוך של כל רקמה חיבורית.

אתרו את המיקום שבו הגידים הדיסטליים מתפצלים לאצבעות הבודדות. חתכו את הגידים בנקודת חיבורם לשכבת השריר העמוקה יותר והסירו את ה-FDB. העבירו את צרור שריר ה-FDB לתוך 1 mL של תמיסת קולגנאז שחוממה מראש ל-37 °C.

הדבק את המבחנה באופן אופקי על שייקר אורביטלי בטמפרטורה של 37 °C ונער במהירות של 200 RPM למשך 65 דקות. עיכול מספיק יבוא לידי ביטוי במראה מפוזר ובצבע חיוור. גזור את קצהו של טיפ פפטה של 1 mL כדי לאפשר למקבץ המעוקל לעבור דרכו.

העבירו בקלות את הצרור לתוך מבחנה לצנטריפוגה המכילה כ-600 µL של 2.5. Calcium tyro. הפכו את המבחנה בעדינות כדי לנער את הסיבים המשוחררים מהצרור.

בשלב הבא, גזרו את קצהו של טיפ פיפט של 30 µL כך שהקוטר יהיה רק מעט קטן יותר מא束 השריר. השתמשו בטיפ זה כדי לשאוב את צרור השריר לתוך הפיפט ולאחר מכן דחפו אותו חזרה אל תוך התמיסה. חזרו על תהליך זה עד שמרבית הסיבים יופרדו מהצרור.

ערבב את הסיבים המופרדים על ידי סיבוב עדין של המבחנה. הוצא את הכמות הרצויה והטלה אותה על צלחת delta T בעלת תחתית זכוכית. אחסן את הסיבים הנותרים בטמפרטורה של 4 °C למשך כשישה שעות לשימוש ובדיקות נוספות.

השאירו את הצלחת ללא הפרעה למשך חמש דקות. פעולה זו מאפשרת לסיבים להיצמד לתחתית הזכוכית של הצלחת. הניחו את הצלחת בעלת תחתית הזכוכית על מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בלייזר UV.

בחן את הסיבים תחת מיקרוסקופ פאזה בהגדלה של יותר מ-100 x כדי לוודא קיומו של דפוס פסיים תקין ומבנה דמוי מוט ישר. הוסף לתמיסה צבעי styro perineum מסוג FM 1 43 או FM 4 64 עד לריכוז סופי של 2.5 micromolar. כוון את הסיב בזווית של 45 מעלות מהפינה השמאלית העליונה של שדה הראייה לפינה הימנית התחתונה כדי לגרום לנזק.

הקרינו שטח של חמישה על חמישה פיקסלים של ממבנה הפלזמה. באמצעות לייזר UV המכוון לעוצמה מקסימלית למשך חמש שניות, האזור המוקרן צריך לפצל את ממבנה הפלזמה כך שחצי מהריבוע של חמישה על חמישה יהיה בתוך הסיב והחלק הנותר יהיה מחוץ לסיב; צלמו תמונות של כניסת הצבע לסיב במרווחים של חמש שניות לכל דגימה למשך עד חמש דקות. ניתן להקרין שלושה סיבים בלבד לכל צלחית, שכן הצבע הפלואורסצנטי יעבור בסופו של דבר אנדוציטוזה לתוך הסיב ויסבך את ניתוח הנתונים.

לאחר שימוש בשלושה סיבים, יש להכין צלחת חדשה. באמצעות תוכנת ניתוח, חשב את השינוי בעוצמת הפלואורסצנציה בשטח של כ-200 מיקרון רבוע להשוואה בין הסיבים. עבור כל פריים יש לבצע את החישוב הבא: delta F חלקי F zero, כאשר F zero הוא ממוצע הפלואורסצנציה של אזור העניין (region of interest) בפריים הראשון שנתפס, ו-delta F הוא השינוי בפלואורסצנציה בכל פריים עוקב.

השתמשו בשיטות סטנדרטיות לטרנספקציית תאים עם DNA פלסמידי המבטא GFP MG 53. לאחר מכן, הכינו את המיקרו-פיפטות. הניחו קפילרה של Pyrex על מיקרו-פיפטה.

ביצוע מתיחה (pull) לפי תוכנית שהוגדרה מראש. הצמדת המיקרו-פיפט למניפולטור מיקרוסקופי תלת-צירי בתרבית. המדיה מוסרת מכלי ה-delta T ומוחלפת בבופר calcium tyro בריכוז 2.5 millimolar.

הניחו את הצלחת המכילה תאים שעברו טרנספקציה תחת מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקת לייזר, המצויד בעדשת שמן 40x 1.3 NA. גרמו לנזק חריף לתא חי על ידי החדרת המיקרו-פיפט לתוך ממברנת התא ולאחר מכן נסוגו במהירות עם המיקרו-פיפט מחוץ לתא. אספו סדרת תמונות של התא החי במרווח של 1.54 שניות לכל פריים עבור הפרעת הממברנה המושרה על ידי טרופונין.

בצעו PERFU של 0.005% troponin בקצב של כמיליליטר אחד לדקה ישירות מעל התא המצולם. ניתן להשתמש בהמסוע למדידת ירידה ביכולת הריצה. לעכברי ה-MG 53 knockout המוצגים כאן יש יכולת ריצה מופחתת עקב נזק לשריר השלד.

היקף הנזק הנגרם על ידי לייזר ה-UV תלוי ביכולת תיקון הממברנה של הסיב הנצפה. כאן מוצג סיב לפני פגיעה בעכבר רגיל. תמונה זו צולמה 200 שניות מאוחר יותר ומראה פגיעה קלה.

סיב שריר המופק מעכברי knockout של MG 53, עם יכולת פגועה לתיקון ממברנה, יראה חדירה משמעותית יותר של צבע לאחר הפציעה. הנה דוגמה לשפופרת שריר (myotube) מסוג C2C12 שעברה טרנספקציה של GFP MG 53 ואינה פגועה. החץ בתמונה זו מצביע על שלפוחיות המכילות GFP MG 53 הנעות לעבר אתרי הפגיעה.

בדוגמה זו, נעשה שימוש בספונין כדי לפגוע בממברנת הפלזמה. שימו לב לתעתוע (translocation) של GFP MG 53 מהציטוזול לממברנת התא לאחר הפגיעה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לבודד סיבי שריר איכותיים בעלי ממברנות סרקופלזמיות חלקות ודפוסי פסיים ברורים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכישו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להעריך את יכולת תיקון הממברנה של שריר ואת תרביות התאים.