תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

מטרת ניסוי זה היא להפיק מבנים דמויי רקמה בתלת-ממד (3D). הדבר מושג תחילה על ידי קציר של תאים מתרבית, ולאחר מכן יצירת תליה של תאים בודדים. בשלב הבא, טיפות של תחתיית התאים מונחות על הצד התחתון של המכסה ההפוך של צלחת תרבית רקמה.

לאחר מכן, הופכים את המכסה על תא ההידרטציה. השלב הסופי הוא דגירה של הטיפות התלויות למשך 24 עד 48 שעות כדי לאפשר היווצרות של אגרגטים. ניתן להעביר אותם לאחר מכן למקלח מים עם ניעור ולדגור למשך חמישה ימים נוספים.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות הבדלים בקוהזיה של אגרגטים או במיון תאים באמצעות בדיקות דחיסה (compaction assays), סימטריה של פני השטח של הרקמה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (epi fluorescence microscopy). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרבית רקמות דו-ממדית (2D) קונבנציונלית, לדוגמה, הוא שתאים הגדלים בתלת-ממד (3D) מחקים בצורה מדויקת יותר את האינטראקציות התאיות שחווים תאים בסביבת רקמה. אני הדגים את השיטה הזו כדי להראות לכם שהיא כה פשוטה, שגם PI יכול לבצע אותה.

כדי להתחיל בניסוי זה, קצרו תאי היצמדות בנשיאות של 90%. ראשית, שאבו את מצע התרבית ושטפו את שכבת התאים פעמיים ב-PBS. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS והעבירו בפיפט שני מיליליטרים של תמיסת 0.05%trypsin EDTA על שכבת התאים (monolayer).

הנח את הצלחת באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degree Celsius והדגר עד להיפרדות התאים. לאחר מכן, הוצא את הצלחת מהאינקובטור ועצור את התהליך על ידי הוספת שני milliliters של מצע גידול מלא.

השתמשו בפיפט של 5 mL כדי לטרטט את התערובת עד שהתאים יהיו בסוספנזיה מלאה. לאחר מכן, העבירו את סוספנזיית התאים למבחנה קונית של 15 mL. העבירו בפיפט 40 µL של תמיסת DNA בריכוז 10 mg/mL אל סוספנזיית התאים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות לאחר ההדגרה.

ערבבו את תרחיף התאים ב-Vortex לזמן קצר ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה ב-200 ×g למשך חמש דקות. עם סיום הסבוב, שאבו את ה-S supernatant והשליכו אותו, ולאחר מכן השעיקו מחדש את המשקע ב-1 ml של מצע גידול מלא לצורך שטיפה. חזרו על הסבוב בצנטריפוגה והשעיקו מחדש את המשקע ב-1 ml של מצע גידול מלא.

בשלב הבא, בצעו ספירת תאים באמצעות סופר תאים אוטומטי או המוציטומטר. התאימו את תרחיף התאים באמצעות מצע גידול לריכוז סופי של 2.5 × 10⁶ תאים למילליליטר. לאחר מכן, המשיכו ליצירת טיפות תלויות.

הכינו תא לחות על ידי הסרת המכסה מכלית תרבית רקמות של 60 מילימטר והטפת 5 milliliters של PBS לתחתית הכלית. הפכו את מכסה הכלית והטפילו עד 2010 microliter של תרחיף תאים על הצד התחתון של המכסה. ודאו כי הטיפות ממוקמות במרחק מספיק זו מזו כדי שלא ייגעו זו בזו.

החזירו בעדינות את המכסה המכיל את תרביות הטיפות אל תחתית הצלחת המכילה PBS. הכניסו את צלחת התרבית לאינקובטור לתרביות רקמה. כווננו ל-37 °C, 5% carbon dioxide ו-95% humidity והדגירו למשך לילה.

יש לעקוב אחר הטיפות מדי יום ולהמשיך בדגירה עד להיווצרות שכבות תאים או אגרגטים. לאחר שהיווצרו שכבות תאים או אגרגטים, העבר אותם לבקבוקי שייקר מזכוכית בעלי תחתית עגולה המכילים 3 mL של מצע גידול מלא. דגער את הבקבוקים המכילים את שכבות התאים או האגרגטים במקלחית רטט.

שמרו בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide למשך כ-24 שעות, עד שניתן יהיה להבחין בהיווצרות הסטרואידים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי. לאחר היווצרות הסטרואידים, ניתן לכמת את השפעת המניפולציות הניסיוניות על היווצרות הסטרואידים בהתאם לנוהל המפורט בפרוטוקול הכתוב. כמו כן, ניתן כעת להבחין באינטרקלציה של צבעים פלואורסצנטיים שנכללו קודם לכן בממברנה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

תמונת מיקרוסקופ בשדה בהיר זו מדגימה את התקבצותם של תאי MLL של סרטן ערמונית של חולדה לאחר 18 שעות של אינקובציה בשיטת הטיפה התלויה (hanging drop). תמונה זו מראה אגרגט שני של תאי MLL שנוצר לאחר 18 שעות של תרבית בשיטת הטיפה התלויה. תאים אלו גודלו בנוכחות 25 micromolar של מעכב ה-MEK שנקרא PD 9 8 0 5 9, דבר שהוביל לאגרגט תאים דחוס משמעותית יותר.

כאן מוצג ההבדל בין גודל האגרגטים בתרבית טיפות תלויות של MLL שטופלה במעכב MEK לבין גודל האגרגטים בקבוצת ביקורת שלא טופלה. הכוכבית מייצגת הבדל מובהק סטטיסטית של P פחות מ-0.0001. כפי שנקבע באמצעות מבחן t של סטודנט בין אגרגטים שלא טופלו לאלו שטופלו במעכב MEK, התוצאות מצביעות על כך שטיפול במעכב MEK מוביל לאגרגטים קטנים ודחוסים יותר באופן מובהק.

תמונה זו צולמה באמצעות מיקרוסקופ סטריאו Nikon Smz 800 ומדגימה סטרואיד שנוצר על ידי דגירה של תאי כבד מעוברים של אפרוחים בתרבית טיפות תלויות למשך 18 שעות, ולאחר מכן במקלח מים רוטט בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 48 שעות. תמונה זו מהמיקרוסקופ הקונפוקאלי מדגימה את התנהגות המיון (sorting out) המתרחשת כאשר אוכלוסיות תאים מסוימות גודלות בתרבית משותפת באמצעות שיטת הטיפות התלויות; לפני המעבר לתרבית טיפות תלויות, תאי כבד מעוברים של אפרוחים נצבעו בצבע PKH2 לצביעת ממברנה ובאפרוחים מעוברים.

תאי לב נצבעו ב-PKH 26. לאחר מכן, תהויי התאים עורבבו והועברו לשיטת טיפה תלויה (hanging drop). התרבית גודלה במשך 18 שעות, ולאחר מכן עברה אינקובציה של 48 שעות במקבץ מים רוטט בטמפרטורה של 37 °C.

ניתן לראות מהחתך האופטי שתאי הלב הצבועים בצהוב עטופים בתאי כבד. צבועים בכחול מדמה כאן, שני שיבוטים של תאי L רגילים ותאים שעברו טרנספקציה המבטאים NCA על פני השטח שלהם. ביחס של 2.4 ל-1, נצבעו עם צבעי ממברנה פלואורסצנטיים, PKH 2 ו-PK KH 26 שערבבו בפרופורציות שוות, ותורבדו כטיפות תלויות כפי שבוצע קודם לכן.

בדוגמה זו, התאים המבטאים רמות גבוהות של cadian, הצבועים בצבע מדמה ירוק, עטופים על ידי תאים המבטאים רמות נמוכות יותר של en cadian, הצבועים בצבע מדמה אדום. לאחר שילטהו בטכניקה זו, ניתן לבצעה ב-30 דקות או פחות אם היא מבוצעת כראוי.