תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית
3 במאי 2011
מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) היא טכנולוגיה המתעוררים מסוגל קליטה הדמיה אופטית ניגודים In vivo עם רזולוציה רגישות הסלולר. כאן, אנו מספקים הדרכה דמיינו על פרוטוקולי הניסוי של OR-PAM, כולל תצורה יישור מערכת מערכת, טיפוסי In vivo הפרוצדורות, וערכות הדמיה תפקודית.
המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית (Optical Resolution Photoacoustic Microscopy), או PAM, של מיקרו-סירקולציה, שהיא לא פולשנית וללא סימון. הדבר משיג תחילה על ידי הרדמת חיית הניסוי. השלב השני של ההליך הוא מיקום אזור העניין באמצעות הזזת ראש הדמיות של המיקרוסקופ הפוטו-אקוסטי ברזולוציה אופטית, לאחר מכן נקבעים פרמטרי הסריקה ונמתחלת רכישת התמונה.
בסופו של דבר, התהליכים של ריכוז החמצן הכולל ורוויית החמצן של ההמוגלובין מתקבלים באמצעות חישוב של נתונים ניסיוניים באורכי גל מרובים. מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית מבוססת על עירור בלייזר וגילוי אולטרה-סוני. קרן לייזר קצרה ממוקדת לתוך רקמה ביולוגית.
בליעת אור יוצרת חימום זמני ופליטה אולטרסונית עוקבת, המתקבלת כדי ליצור תמונה. היתרון הייחודי של RPM הוא גילוי ללא סימון ורגישות יוצאת דופן לבליעה אופטית. בניגוד לכך, טכנולוגיות מיקרוסקופיה אופטית קיימות, כולל רפלקסיה, רגישות בעיקר לפיזור אופטי או פלואורסצנציה. היכולת לספק דימוג ברזולוציה גבוהה ללא סימון in vivo של בליעה אופטית הופכת את ה-RPM לבעל יישומים ביו-רפואיים רחבים בנוירולוגיה, אופתלמולוגיה, ביולוגיה וסקולרית ודרמטולוגיה.
מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית, או pamm, מורכבת מרכיבים אופטיים ואולטרסוניים. מקור ההקרנה האופטי הוא לייזר צבע המופעל על ידי לייזר פולסים במצב מוצק. קרן הלייזר הפלט מוחלשת באמצעות מסנן צפיפות ניטרלית ומוזנת לסיב אופטי במוד אחד להולכת אור, כדי לאפשר סריקה מכנית של ראש הדימות של המיקרוסקופ במקום סריקה של האובייקט החי, ובכך להבטיח צימוד יעיל של קרן הלייזר רב-המודים לתוך סיב אופטי במוד אחד.
ראשית, הוא מסונן על ידי חור סיכה (pinhole) בעקיר של 50 מיקרומטר. חור הסיכה ממוקם במרחק קל מהמיקוד של עדשת המקרין כדי להתאים את קוטרו לקוטר קרן האור במודב הבסיס. כדי ליצור מיקוד אופטי המוגבל כמעט רק על ידי עקיפה, הפלט של הסיב החד-סיבי מוקבל וממלא את המפתח האחורי של עדשת המיקרוסקופ.
הגילוי האולטרסוני כולל משלב קרן אקוסטי-אופטי שהוקם במעבדה ומחובר למתמר אולטרסוני. המשלב מיישר את ההקרנה האופטית ואת הגילוי האקוסטי באופן קו-אקסיאלי. חלל כדורי נשחק בתחתית המשלב כדי ליצור עדשה אקוסטית עם מספר צרירי (numerical aperture) של 0.5 במים, המספקת קוטר מוקד אקוסטי של 43 micrometers בתדר מרכזי של 50 megahertz.
עבור היישור הראשון, מומלץ להשתמש באולטרסאונד מסוג pulse echo כדי לקבוע את מיקומו של המישור המוקדי האקוסטי. ראש ההדמיה מכוון אנכית עד שמתקבל אות האולטרסאונד החזק ביותר. כדי למקסם את רגישות הגילוי, המוקדים האופטיים והאקוסטיים מיושרים.קונפוקלי.
מטרה הסופגת אור, כגון חתיכה של סרט בידוד שחור, ממוקמת במישור המוקד האקוסטי. לאחר מכן, מתואמת נקודת המוקד האופטית כדי למקסם את האות הפוטו-אקוסטי. מערכת ה-PAM כוללת גם מגברים אלקטרוניים וממיר אנלוגי-דיגיטלי, סורק מכני ובקר סורק.
האות המודגש מועבר למחשב לצורך יצירת תמונה. התוכנה ממירה את נתוני הגלם לרצף של תמונות חתך במישור bcan. בעוד ראש המיקרוסקופ סורק את האובייקט בסריקה רסטרית, ניתן להציג את התמונות המוקלטות כתמונות חתך בודדות, תמונות השלכה של אמפליטודה מקסימלית בדו-ממד (2D maximum amplitude projection) או הדמיות בתלת-ממד.
מיכל מים משמש לאכלוס ראש הדימיון של המיקרוסקופ. חלון דימיון נחתך בתוך צלחת פטרי ונחתם באמצעות ממבנה פוליאתילן שקוף אולטרסונית ואופטית. הגל הפוטו-אקוסטי הנוצר מהאובייקט מצומד אקוסטית לגלאי האולטרסאונד ראשית על ידי ג'ל אולטרסאונד בין האובייקט לממברנת הפוליאתילן, ולאחר מכן על ידי מים דה-יוניים בצלחת הפטרי.
המצאות ואפליקציות אלו של לייזרים אופטיים זמינים ושל המתמר האולטרסוני מרכיבים את מערכת ה-or pam. במקטע הבא, נדמיין את כלי הדם הזעירים של עכבר חי באמצעות מערכת זו. אם החיה המדומיינת אינה עכבר עירום, רצוי להסיר את הפרוCה 24 שעות לפני הניסוי.
כך נסוג הגירוי של כלי הדם בעור. הרדמנו את העכבר באמצעות 3% ISO fluorine המאודה בחמצן בדרגה רפואית. קצב הזרימה הטיפוסי הוא בין 1 ל-1.5 ליטר לדקה.
בהתאם למשקל גוף בעל החיים. שמרו על ההרדמה באמצעות 1% ISO fluorine. לאורך כל הניסוי, בצעו צביטה של בהונות כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין. העבירו את העכבר לבמה סטריאוטקטית עם משטח חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו ב-37 °C.
כעת השטיחו את האוזן על הפלטה הפלסטית. לאחר מכן, מרחו שכבת ג'ל אולטרה-סאונד מעל האוזן. הימנעו מלכוד בועות אוויר בתוך הג'ל.
יש למרוח גם פומדת עינית לעיניים כדי למנוע התייבשות או נזק מקרי מהלייזר. הימנעו ממגע ישיר של האפליקטור בעין. לאחר מכן, מקמו את האוזן תחת חלון ההדמיה והגביהו לאט את במת בעל החיים עד שג'ל האולטרסאונד יבוא במגע עם תחתית הממברנה.
נדרש מגע עדין מכיוון שלחיצה של האוזן כנגד הממברנה עלולה להשפיע על זרימת הדם באוזן. לאחר מכן, יש לנקוט במספר אמצעי זהירות עם בעל החיים כדי לנטר את מצבו הפיזיולוגי. הצמד מד סטורציה (pulse oximeter) לרגל או לזנב של העכבר.
כעת הורד את ראש הדמיה עד שהעדשה האקוסטית טבולה במים דאיוניים והסר בועות כלואות מתחת לעדשה האקוסטית. הגדר את הלייזר למצב טריגר חיצוני והתחל בסריקת ניסיון. כוון את מיקום ציר Z של ראש הדמיה עד שהמוקדים הכפולים, האופטי והאקוסטית, ממוקמים במרכז האוזן.
כעת הגדירו את פרמטרי הסריקה והתחילו ברכישת תמונות פורמלית. כדי למדוד את ריכוז ההמוגלובין הכולל, הגדירו את אורך הגל לנקודה איזוסבסטית שבה לאוקסיהמוגלובין ולדה-אוקסיהמוגלובין יש מקדמי ספיגה מולרית שווים.
למדידת רוויית חמצן של המוגלובין, הגדירו את אורך הגל השני לנקודה שבה קיים הבדל מובהק בין מקדמי האטיליות המולריים של האוקסיהמוגלובין והדאוקסיהמוגלובין. עם הסיום, נקו את אוזנו של העכבר והניחו את העכבר באינקובטור. כאשר טמפרטורת הסביבה מכוונת ל-37 °C, לאחר התעוררותו, החזירו את העכבר באופן טבעי למתקן גידול בעלי החיים.
תמונת הקרנה זו של אמפליטודה מקסימלית מראה את האנטומיה של כלי הדם באוזנו של עכבר עירום חי, שצולמה באמצעות o-PAM באורך גל של 570 nanometers. תמונת הקרנה זו מראה את רמת רוויית החמצן של ההמוגלובין באותה אוזן. היא מחושבת מתוך התמונות שנרכשו באורך גל איסו-ספסטי של 570 nanometers ובאורך גל השולט בספיגת דאוקסי-המוגלובין של 561 nanometers.
מבט מקרוב על האזור המסוגר מראה את הרזולוציה של ה-oramm. מיטת נימיים צפופה נראית בבירור. בסרטון זה, הדגמנו את הפרוטוקול הניסויי הטיפוסי עבור ORPM, כולל תצורת המערכת, כיול המערכת, הליך ניסויי in vivo ותוכנית דימוי תפקודי.
אחד ההיבטים החשובים ביותר בתכנון המכשיר ובתפעולו הוא היישור הקונפוקאלי האופטי-אקוסטי, שחיוני לרגישות הדימוי ולרזולוציה האופטית. מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית, בשילוב עם מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אקוסטית בעלת חדירה עמוקה וטומוגרפיה ממוחשבת פוטו-אקוסטית, מבטיחות דימוי פונקציונלי ומולקולרי in vivo ובסדרי גודל מרובים; ניתן לדמיין תאים, רקמות ועד לאיברים שלמים באותה רמת ניגודיות. יכולת זו של סקילביליות בדימוי טומנת בחובה את הפוטנציאל לחולל מהפכה במחקר של מערכות ביולוגיות רב-סולמיות ובבתרגום של תגליות מעבדה מיקרוסקופיות לפרקטיקה קלינית מקרוסקופית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט למיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית (OR-PAM), טכניקה של דימות לא פולשני המספקת רזולוציה תאית in vivo. ההליך כולל הרדמה של בעל החיים, מיקום ראש הדימות ורכישת תמונות לצורך ניתוח של המיקרו-סירקולציה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית
רקע
- OR-PAM היא טכנולוגיית דימות חדשנית.
- היא מאפשרת דימות של ניגודיות בבליעה אופטית.
- הטכניקה אינה דורשת סימון (label-free) והיא אינה פולשנית.
- היא מספקת תובנות לגבי מיקרו-סירקולציה ורמות חמצן ברקמות.
מטרת המחקר
- להדגמה של השימוש ב-OR-PAM in vivo.
- למתן הדרכה חזותית על הפרוטוקולים הניסיוניים.
- לשיפור ההבנה של דינמיקת המיקרו-סירקולציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמת בעל החיים הניסויי.
- מיקום אזור העניין לצורך הדמיה.
- הגדרת פרמטרי סריקה לרכישת תמונה.
- חישוב ריכוז חמצן כולל ורוויה מנתוני רב-אורכי גל.
תוצאות עיקריות
- דימוג מוצלח של מיקרו-סירקולציה in vivo.
- רכישת נתונים על ריכוז ורוויית חמצן.
- הדגמה של אופיה הבלתי פולשני של הטכניקה.
- תיקוף של OR-PAM ככלי לדימוג פונקציונלי.
מסקנות
- OR-PAM יעיל לדימות של מיקרו-סירקולציה.
- הטכניקה מספקת מידע בעל ערך על חמצון רקמות.
- יש לה יישומים פוטנציאליים בתחומי מחקר ביו-רפואיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיה פוטו-אקוסטית ברזולוציה אופטית (OR-PAM) תלת-ממדית מאפשרת דימות לא פולשני, ללא סימון ובחלונית רזולוציה גבוהה של בליעה אופטית ברקמות, ובכך מספקת תובנות פונקציונליות ופיזיולוגיות ברמה של המיקרו-כלי דם. יכולת זו נותנת מענה לפער קריטי בדימות בשלבי הגילוי על ידי כימות החמצון ודינמיקת ההמוגלובין in vivo, ובכך תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים ובהמשכיות תרגומית. השילוב של גילוי אופטי ואקוסטי ב-OR-PAM מציע ערך ייחודי לתיקוף מטרות ולביטחון חיזוי בקווי מחקר פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של חמצון רקמות ורוויית המוגלבין לצורך בחינת מטרות תפקודיות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות תגובות פיזיולוגיות במיקרו-כלי דם שלמים.
- מסייע בביסוס ביטחון חיזוי לגבי מעורבות המטרה (target engagement) באמצעות פלטים של דימות כמותי וללא סימון.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מכין מודלים מאושרים in vivo לסריקת תרכובות להמשך ולמחקרים מכניסטיים.
- מספק מדידות כמותיות הניתנות לשחזור של תפקוד מיקרו-וסקולרי וחמצון.
- מאפשר סטנדרטיזציה של בדיקות ויכולת הרחבה של הפלטפורמה עבור תהליכי עבודה של דימות עתיר תוכן (high-content imaging).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את פלטי הדימוי לסמנים ביולוגיים פיזיולוגיים הרלוונטיים למחלה, כגון רוויית חמצן.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בדימות תפקודי רב-קנה.
- מפחית את הסיכון בקבלת החלטות לגבי המשך קידום הפיתוח על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של פרמקודינמיקה ברמת הרקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
OR-PAM משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין תיקוף של סמנים ביולוגיים תרגומיים באמצעות דימות כמותי in vivo.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובהבהרת מסלולים על ידי מדידה של שינויים פיזיולוגיים בזמן אמת במיקרו-סירקולציה.
- סקר (Screening): מספקת דימות הניתן לשחזור ומוכן לבדיקה של פרמטרים של כלי דם וחמצון לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת קריאות כמותיות של ריכוז המוגלובין ורוויית חמצן לצורך השוואה סטטיסטית חזקה.
- מחקר תרגומי: מקשרת נתוני דימות תפקודי לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים פרה-קליניים כאשר הם תואמים למודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת דימות רב-פעמית למחקרים תפקודיים רב-קנה-מידה ורב-איברים לאורך תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: מספק תזרימי עבודה של דימות סטנדרטיים, הדירים וניתנים להרחבה עבור מחקרי in vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים פיזיולוגיים ברי-יישום.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף וקידום של מועמדים המותאמים לסיכון, על בסיס ראיות מדימות פונקציונלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכיול מערכות אופטיות ואקוסטיות ובפרוטוקולי דימות in vivo.
- נדרשת גישה לציוד ייעודי של לייזר, אולטרהסאונד ורכישת נתונים.
- נחוץ סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הדימות ותהליכי ניתוח הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה לסוגי רקמות שונים או למודלים של בעלי חיים בהתבסס על תכונות אופטיות.
- הרגישות והרזולוציה של הדימות תלויות בכיול קונפוקאלי אופטי-אקוסטי מדויק.
