פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell
8 ביולי 2011
אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשקיט (knock down) את ביטויו של גן המטרה ב-DCS באמצעות טרנספקציית siRNA. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנות של effector AM Maxin Nucleo. השלב השני של הפרוצדורה הוא ערבוב של DCS ו-siRNA יחד והעברת תמיסת התאים שהתקבלה באמצעות פיפטה לתוך מודולי Nucleo QVE.
השלב השלישי של הפרוטוקול הוא הנחת הפלטה במגש המעבורת של ה-amaxa כדי להתחיל בתהליך הטרנספקציה. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא הדבקת התאים בנגיף כדי להפעיל את תגובת האינטרפרון. לבסוף, ניתן לקבל תוצאות המראות השתקה של גנים באמצעות quantitative R-T-P-C-R ו-Western blotting.
טכניקה זו בעלת ערך לאפיון מסלולי אותות בתאי דנדריטיים ועשויה לתרום לפיתוח טיפולים חיסוניים המבוססים על תאים דנדריטיים. כדי לתכנת את גורם הגרעין של המעבורת Maxon בעלת 96 בארות עבור טרנספקציית DC, פתחו קובץ פרמטרים חדש. בחרו את מספר הבארות שבהן תשתמשו לטרנספקציה סטנדרטית על ידי גרירת הסמן מעל תרשים פלטת 96 הבארות.
השתמשו בלפחות שלוש בארות לאיגור (pooling) עבור כל דגימה ניסיונית. כעת הזינו את קוד התוכנית: בחלק הראשון בחרו F, F ובחלק השני בחרו 1 68 מתוך התפריטים הנפתחים. לאחר מכן, מתיבת התמיסות, בחרו monocyte human, ותחת אפשרות הבקרה בחרו standard, ואז לחצו על apply.
כדי לכלול בקרת ביטול טרנספקציה, יש לבחור בארות נוספות מהתרשים. לאחר מכן, מתוך אפשרויות הבקרה, בחר בבקרת "ללא תוכנית" (no program control) ולחץ שוב על apply. לאחר ערבוב תמיסת ה-nucleofection, המתן עד שהיא תגיע לטמפרטורת החדר.
הניחו את מספר מודולי ה-nucleo vete הדרושים בתוך פלטת ה-nucleo VETE בכיוון הנכון, כפי שמוצג כאן, על ידי הכנסת המודול הראשון לשורות אחת ושתיים, וכך הלאה עבור כל שאר המבחנות. העבירו כמות מספקת של DCS מבקבוק תרבית תאים למבחנה של 50 milliliter כך שיהיו 500,000 תאים לבאר עבור הטרנספקציה; סבבו את התאים בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-400 G בטמפרטורה של 4 °C, ולאחר מכן הסירו בזהירות את העלייה. לאחר מכן, הוסיפו למבחנה תמיסת nuclear affection והשביו את ה-DCS למצב צבירה הומוגני על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה מספר פעמים.
כעת סמנו את מבחנות ה-DPH בהתאם לטיפול הספציפי שיבוצע, ולאחר מכן חלקו את התאים שהושחיו למבחנות המסומנות. הוסיפו siRNA בריכוז סופי של 0.25 micrograms ל-500,000 תאים למבחנות ה-epi endorf המתאימות, ולאחר מכן ערבבו את תרחיפי התאים באמצעות פיפטינג. השתמשו ב-siRNA שאינו מכוון למטרה (non-target siRNA) עבור דגימת ביקורת ללא טרנספקציה.
לאחר מכן, טפטפו 20 µL מתליה של תאי ה-SI RA DC אל תוך מודולי ה-nucleo vete בהתאם למערך הניסוי שתוכנן מראש, תוך וידוא שהנוזל מגיע לתחתית הבאר. כסו את פלטת ה-nucleo vete במכסה והקישו על הפלטה מספר פעמים על משטח קשיח כדי להקל על הסרת בועות אוויר לצורך טרנספקציית ה-dcs. הכניסו את פלטת ה-nucleo Yvette המוכנה למגש המעבורת של ה-nucleo effector בעל 96 בארות. לאחר מכן, לחצו על כפתור ה-upload and start.
עקבו אחר התקדמות תהליך הטרנספקציה על הצג. איקס שחור על רקע ירוק מעיד על טרנספקציה מוצלחת באותה באער, בעוד שפס שחור על רקע אדום מעיד על כישלון בעוד התאים עוברים טרנספקציה. חממו מראש את מצע הגידול DC עם סיום תהליך הטרנספקציה, הוציאו את הפלטה והוסיפו 80 µL של מצע הגידול DC המחומם לכל באער.
השתמשו בפיפט רב-ערוצי וכעת הדגירו את הפלטה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 °C וב-5%CO2. במהלך תקופת ההדגרה, הוסיפו 100 µL של מצע גידול DC שחומם מראש לשפורי המטריצה, באותה התמצאות שבה הוכנה פלטת ה-nucleo cuvette. לאחר תקופת ההדגרה, העבירו את כל 100 µL של תרחיפי התאים מה-nucleo CVEs אל שפורי המטריצה שהוכנו מראש.
לאחר מכן, הסירו והשליכו את המבחנות שבהן לא התרחשה טרנספקציה. לבסוף, דגרו את מבחנות המטריצה למשך 24 שעות או לפרק זמן רצוי אחר. סמנו מבחנות einor עבור כל אחת ממבחנות המטריצה שנדגרו.
לאחר מכן, העבירו את מבחנות המטריצה מהאינקובטור למנדף תרביות תאים וקבצו את מבחנות המטריצה עבור כל דגימה ניסויית אל תוך מבחנות ה-eend dfs שסומנו מראש. בשלב הבא, השקיעו את התאים בעדינות על ידי סבוב מבחנות ה-eend DPH בצנטריפוגת שולחנית למשך 10 דקות ב-400 G. הסירו את ה-snat והשביו את התאים באופן רפוי בתרגיב גידול נטול סרום המכיל נגיף מחלת ניוקאסל או NDV ב-MOI של one.
כסו את ה-epi endorphins באופן סטרילי ולאחר מכן דגרו את המבחנות למשך 45 דקות. לאחר תקופת דגירה זו, הוסיפו 900 µL של מצע גידול DC ודגרו שוב את המבחנות למשך שמונה עד 10 שעות נוספות, כדי לקצור את ה-dcs שעברו טרנספקציה והדבקה.
שקעו את התאים על ידי סבוב של מבחנות ה-einor בצנטריפוגת שולחנית כפי שבוצע קודם לכן והסירו את ה-snat. תאי monocyte dcs עברו טרנספקציה עם siRNA המכוון ל-RIG I או עם glow irna לא ספציפי, והודבקו ב-NDV כפי שסומן בסימן פלוס, או נותרו ללא הדבקה כפי שסומן בסימן מינוס, כפי שזוהה באמצעות quantitative R-T-P-C-R. נצפתה הפחתה (knockdown) של R RGA ב-75% ברמת השעתוק, ונצפתה הפחתה דומה בביטוי של interferon beta, אפקטור במורד הזרם (downstream effector) של RGA במסלול איתות האינטרפרון. יתרה מכך, ביטוי של interferon beta בתאי ביקורת שעברו טרנספקציה אך לא הודבקו לא היה ניתן לזיהוי.
בעוד שהתגובה של MXA ושל גן תגובה במורד מסלול האינטרפרון בטא הייתה מינימלית. כאן מוצגים נתונים מהטרנספקציה שנייה של DCS עם irna המכוון ל-rigi, שבוצעה כבאיור הקודם. עם זאת, כל התאים הוזיהו ב-NDV, ושולבה בקרה נוספת באמצעות Monocyte DCS לא חתוכים.
תוצאות השתקת הגנים היו דומות לאלו שנצפו באיור הקודם. Western blot שבוחן RGA גילה כי הביטוי החלבוני של גן זה נחסם לחלוטין. נתיבים אחת ושתיים מציגים נתונים עבור ליזאטים מתאי לא-כריתים.
נתיבים שלושה וארבעה מראים ליזאטים מתאים תאים שעברו טרנספקציה של glow irna, ונתיבים חמישה ושש מראים ליזאטים מתאים תאים שעברו טרנספקציה של S irna המכוון ל-RIG I. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה אחת, כולל השתקה של גנים רבים בו-זמנית.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול נוקלאופקציה (nucleofection) אופטימלי בעלת תפוקה גבוהה לטרנספקציה של תאי דנדריטיים ראשוניים המופקים ממונוציטים אנושיים באמצעות plasmid DNA או siRNA. השיטה מבטיחה כי תהליך הטרנספקציה אינו גורם להשראת הבשלת התאים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- ביולוגיה מולקולרית
רקע
- טרנספקציה של תאים דנדריטיים היא קריטית לחקר תגובות חיסוניות.
- שיטות מסורתיות עלולות להוביל להבשלה בלתי רצויה של התאים.
- דרושות טכניקות יעילות להשתקת גנים עבור מחקרים תפקודיים.
- siRNA יכול להביא להשתקה (knock down) יעילה של ביטוי גן המטרה.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול נוקלאופקציה (nucleofection) בעלת תפוקה גבוהה.
- טרנספקציה של תאי דנדריטיים ללא השראת הבשלה.
- הדגמה של השתקה גנטית מוצלחת של RIG-I.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנות של effector AM Maxin Nucleo.
- ערבוב של תאים דנדריטיים ו-siRNA לצורך טרנספקציה.
- שימוש במודולים של Nucleo QVE לצורך פיפטור של תמיסות תאים.
- שימוש ב-RT-PCR כמותי וב-Western blotting לניתוח התוצאות.
תוצאים עיקריים
- טרנספקציה מוצלחת של תאי דנדריטיים ללא הבשלה.
- הש tackledה יעילה (knockdown) של הגן RIG-I ברמות ה-mRNA והחלבון.
- ניתן ליישם את המתודולוגיה שהודגמה במחקרים שונים.
- התוצאות תוקפו באמצעות quantitative RT-PCR ו-Western blotting.
מסקנות
- פרוטוקול הנוקלאופקציה המותאם הוא יעיל ואמין.
- שיטה זו יכולה לשפר מחקרים על תגובות חיסוניות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול ניסויי השתקה של גנים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
טרנספקציה יעילה של תאי דנדריטיים ראשוניים ללא השראה של הבשלה פותרת צוואר בקבוק קריטי בתהליכי גילוי תרופות ותיקוף מטרות הממוקדים באימונולוגיה. פרוטוקול זה מאפשר מניפולציה גנטית מדויקת למחקרים מכניסטיים, תומך בביטחון חיזוי בחקירת מסלולים חיסוניים ומסייע לקידום מותאם-סיכון של מועמדים לאימונותרפיה. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בניהול פורטפוליו על ידי מתן אפשרות לגנומיקה פונקציונלית חסונה וניתנת לשחזור במערכת רלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השתקה פונקציונלית (knockdown) של גנים של סיגנלינג חיסוני בתאי דנדריטיים ראשוניים לצורך הפחתת סיכונים במסלולי הסיגנלינג.
- תומך בתיקוף מכניסטי של מטרות חיסוניות ללא הפרעות של ארטיפקטים של הבשלת תאים.
- מקל על חקירה מונחית-השערה של חיישני מערכת החיסון המולדת ואפקטורים במורד המסלול.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לבחירת מטרות בצינורות פיתוח של אימונותרפיה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תהליך עבודה סטנדרטי בעל תפוקה גבוהה להפרעה גנטית בתאי חיסון ראשוניים.
- מספק תוצאות כמותיות (qRT-PCR, Western blot) לצורך פיתוח ואופטימיזציה של בדיקות חסונות.
- מאפשר הערכה ניתנת לשחזור של תפקוד גנים וסיגנל של מסלולים בביצוע מסעות סריקה.
- מפחית שונות על ידי שמירה על חוסר הבשלות של תאי דנדריטים במהלך הטרנספקציה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאימה מודולציה חיסונית in vitro להקשרים תאיים הרלוונטיים למחלה לצורך המשכיות תרגומית (translational continuity).
- תומכת בגילוי ותיקוף של ביומארקרים על ידי מתן אפשרות להשתקה ממוקדת של גנים בתאים ראשוניים.
- מקל על הערכה פרה-קלינית של התערבויות במסלולים חיסוניים עם בהירות מכניסטית.
- מפחיתה סיכונים בקידום אסטרטגיות של מודולציה חיסונית על ידי אישור מעורבות המטרה (target engagement) בתאים אנושיים ראשוניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קלייני, על ידי מתן אפשרות למניפולציה גנטית של תאי דנדריטיים ראשוניים לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ומחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומך בבדיקת השערת האפס ובצמצום סיכונים מכניסטיים של מטרות חיסוניות.
- סריקה (Screening): מספק פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק נתונים חזקים של השתקת גנים וביטוי חלבונים לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר תרגומי: שומר על הקשר תאי רלוונטי למחלה עבור מחקרי סמנים ביולוגיים ומסלולים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה בעלת תפוקה גבוהה לשימוש חוזר בתוכניות של מטרות חיסוניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי נתיבי חיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי טרנספקציה וקריאת נתונים (readout) לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) וקידום פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם-סיכון של מטרות ואמצעי טיפול אימונותרפויטיים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים ראשוניות ובמכשור לנוקלאפקציה (nucleofection).
- דורש גישה לפלטפורמות אנליטיות כמותיות (qRT-PCR, Western blot).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הטרנספקציה והקריאה.
- עשוי לדרוש התאמה עבור מקורות תורמים שונים או תת-סוגים של תאי מערכת החיסון.
- יש לתקף את ספי יעילות החיות עבור כל הקשר ניסיוני.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Program the Amaxa 96-well Shuttle Nucleofactor
2:00
Prepare DCs for Transfection
3:40
Transfect DCs
5:07
Infection and Harvest of Cells with Newcastle Disease Virus
6:09
siRNA Gene Targeting Results in Drastic Reduction of Message and Total Reduction of Protein Expression in Monocyte DCs
7:51
Conclusion
