כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

בדיקת השתלה של תאי דילול מגבילה (limiting dilution cell transplantation assay) היאe מדד הזהב להערכת פוטנציאל התחדשות עצמית במודלים של בעלי חיים ניסויים. בהדגמה זו, מוזרקים לעוברים של דגי זברא סינגניים בשלב של תא אחד rag two MIC ו-RAG two GFP כדי ליצור דגי זברא טרנסגניים שיפתחו לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T המסומנת פלואורסצנטית. ביום ה-60 לחייהם, תאי הלוקמיה הראשוניים מבודלים מדגי הזברא ולאחר מכן מטוהרים באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטית (fluorescence activated cell sorting).

בשלב הבא, התאים מושתלים בדילול מגביל לחלל הפריטונאום של דגי זברה בוגרים, והדגים נ monitored למעקב אחר צמיחת גידולים למשך עד 90 ימים. לבסוף, נעשה שימוש בתוכנה הסטטיסטית לניתוח דילול מגביל קיצוני כדי לכמת את השכיחות של תאים מפיצים של לוקמיה בתוך הגידול המקורי. ניתוח השתלת תאים בדילול מגביל מאפשר לחוקרים להעריך במדויק את מספר התאים בעלי יכולת התחדשות עצמית הנמצאים בתוך מסת הגידול הכוללת.

תאים אלו, המתחדשים באופן עצמי, הם המניעים את היווצרות הסרטן והם האחראים בסופו של דבר להישנות המחלה. היתרון המרכזי בביצוע בדיקות השתקה בדילול מגביל (limiting dilution transplantation assays) במודל דג הזברה הוא שניתן להשתיל מספר רב של דגים בכל ניסוי, דבר המוביל לדיוק גבוה יותר בקביעת השכיחות של תאים מפיצים גידולים בעלי התחדשות עצמית. שיטה זו מספקת תובנות לגבי תאים מפיצי גידולים בלוקמיה לימפובלסטית חריפה מסוג T-cell.

ניתן ליישם זאת גם להבנת מודלים אחרים של סרטן בדגי zebrafish. ג'סיקה בלקברן, עמיתה במעבדה, וסאלי ליו, טכנאית מוכשרת, ידגימו עבורכם את הפרוצדורה היום. כדי לבצע לינאריזציה של מבני ה-DNA של Rag2 CM ו-RAG2 GFP, עיכלו 10 µg מכל פלסמיד באמצעות האנזים NotI בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. לאחר מיצוי בפנול-כלורופורם ושיקיעה באתנול, המיסו כל פלסמיד ב-20 µL של מים.

קבעו את ריכוזי ה-DNA על ג'ל אגרוס 1% על ידי הרצת דילול של אחד לאחד, אחד לחמישה ואחד לעשרה של כל פלסמיד שעבר עיכול, יחד עם 20 µL, 10 µL וחמישה µL של סולם DNA בטווח גבוה. כעת דללו את ה-DNA לריכוז סופי של 60 ng/µL להזרקה למאמץ CG one syngen. להזרקה לעוברי זבבורג (zebrafish) השתמשו ב-250 nL של 30 ng/µL rag two CM ו-30 ng/µL.

החדירו שני GFP לתא אחד של עוברי זברופיש (zebrafish) בשלב התא הבודד, תוך התמקדות מדויקת בהזרקת ה-DNA ישירות אל התא ולא אל החלמון. אחסנו את העוברים המוזרקים בטמפרטורה של 28.5 °C והסירו את העוברים המתים לאחר 24 שעות. בחמישה ימים לאחר הלידה, העבירו את בעלי החיים למכלי גידול גדולים, בערך 28 ימים לאחר ההזרקה. הרדימו את זחלי הזברופיש על ידי הוספת 200 µL של Tricaine בריכוז 4 ng/mL לתוך 25 mL של מי מערכת דגים בתוך צלחת פטרי.

בחן את הזחלים לאיתור התפתחות של TALL המסומן פלואורסצנטית, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפי (epi fluorescence microscope) לזיהוי פלואורסצנציית GFP. הפר את הזחלים החיוביים לגידול מאלו השליליים כדי להבטיח ששום דג לוקמי לא יופס בניתוח. ניתן לבחון את הזחלים השליליים בנקודת זמן מאוחרת יותר, לאחר שהגידולים עשויים להיות גדלים. עקוב אחר דגים לוקמיים המסומנים פלואורסצנטית לפחות פעם בשבוע באמצעות מיקרוסקופ הפלואורסצנציה האפי כדי לנטר את צמיחת הגידול.

כאשר תאי לוקמיה חיוביים ל-GFP תופסים יותר מ-50% מגופו של בעל החיים, הוסיפו מיליליטר אחד של Trica S בריכוז של ארבעה ננוגרם למילילטר לצלחית פטרי המכילה תשעה מיליליטרים של מי מערכת דגים כדי להקריב את הדג. העבירו את הדג לצלחית פטרי חדשה המכילה מיליליטר אחד של 5% fetal bovine serum ב-0.9 X PBS. מעכו את הדג באמצעות להב תער, ושאי את התערובת באמצעות פפטה כדי להפריד גושי תאים גדולים. לאחר מכן, העבירו את התאים דרך מסננת רשת של 40 מיקרומטר למבחנה של 50 מיליליטר.

העבירו בפיפט 500 µL מהתאים למבנה פוליסטירן של 4 mL. הוסיפו 1 µL של peridium iodide בריכוז 1 mg/mL לסמן תאים מתים, ערבלו במכשיר vortex, ולאחר מכן שמרו את התאים על קרח. הכינו גם דג CG1 מסוג פרא (wild type) כדי לאסוף תאי דם רגילים, שישמשו כנשא לתאי הגידול במהלך השתלה, על ידי הוספת 4 mL של 5% FPS ב-0.9 X PBS למבנה של 50 µL, לנפח כולל של 5 mL.

ספרו את תאי הדם הנורמליים ודללו אותם לריכוז של 3 × 10⁵ תאים למיליליטר ב-5% FBS ב-0.9 x pbs, ולאחר מכן העבירו בפיפטה 100 µL לכל באר בלוח 96 בארות. בעזרת ממייין תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS), מייינו תאי גידול חיוביים ל-GFP ושליליים ל-PI אל תוך לוח 96 הבארים המכיל תאי דם במינונים המצוינים. בנוסף, מייינו 10,000 תאים לבאר ללא תאי דם נורמליים ובצעו ניתוח חוזר באמצעות FACS כדי להעריך את טהרתם וחיוניותם של התאים הממויינים. סובבו את לוח 96 הבארים בצנטריפוגה ב-2000 ×g למשך 10 דקות כדי לשקע את התאים.

הסר 95 µL מה-snat ושחזר את התאים ב-5 µL הנותרים. הזרק את תמיסת התאים לחלל הפריטונאום של דגי זבברה (zebrafish) סינגניים בוגרים בני יותר מ-60 יום, באמצעות מיקרו-מזרק בקוטר 26.5 gauge. אין צורך להרדימ את דגי הזבברה לפני השתלה.

השתילו 45 דגים עם 10 תאי לוקמיה, 20 דגים עם 100 תאים, שבעה דגים עם 1,000 תאים וחמישה דגים עם 10,000 תאי TALL, כ-28 ימים לאחר ההשתלה. בחנו את דגי הזברה המקבלים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה (epi fluorescence) תוך שימוש באורך גל עירור של 485 20 ובמסנן פליטה של 530 25, כדי לזהות פלואורסצנציית GFP.

רשמו את מספר הדגים החיוביים ביחס למספר הדגים הכולל שהוזרקו. בדקו שוב את הדגים בכל 14 ימים עד ליום ה-90 ורשמו את מספר הדגים החיוביים. כאשר מספר הדגים עם גידולים חיוביים עולה.

יש להקריב את החיה באמצעות מנת יתר של trica US, להזין את התוצאות לתוך טבלה ולהעלות את הנתונים לתוכנת ניתוח דילול מגבילי קיצוני (extreme limiting dilution analysis) מבוססת רשת כדי לקבוע את השכיחות של תאי לוקמיה בעלי יכולת התחדשות בתוך ה-primary TALL CG one strain. עוברים הוזרקו עם RAG two cmic, וזחלי RAG two GFP נסרקו למסכי primary TALL. לאחר 28 ימים, ובהתאם לעבודות קודמות, לכ-5% מהדגים המוזרקים יש תאי T חיוביים ל-GFP בתוך התימוס שלהם, ו-100% מדגים אלו יפתחו לוקמיה. כאן, תאי TALL מסומנים פלורוצנטית מופקים באמצעות מיון מחיות חולות בנות 65 ימים, ומשמשים בבדיקת השתלת תאים בשיטת דילול מגבילי. ראשית, הוגדר שער (gate) לבחירת תאים בודדים.

לאחר מכן נבחרו תאים שליליים ל-propidium iodide. ולבסוף שרטט שער (gate) כדי לבחור רק את תאי הלוקמיה החיוביים ל-GFP לצורך מיון. בדוגמה זו של דגים המושתלים ב-TALL ביום ה-28, נראו גידולים בשלב מוקדם כאזור של תאים חיוביים ל-GFP ליד אתר ההזרקה.

בעוד שחלק מה-TLS היו בשלב מתקדם יותר והתרחבו עד למילוי החלל הפריטוניאלי עבור ניסויים אלו, בוצעו השתלות בלמעלה מ-220 בעלי חיים, פעולה שניתן לבצע בקלות על ידי אדם אחד בתוך מספר שעות. ניתוח נתונים באמצעות תוכנת elda הראה כי בממוצע, אחת מתוך 135 תאי T all הייתה תא לוקמיה מתחדש המפיץ את המחלה. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו משתילים תאי גידול בדילול מגביל אל תוך החלל הפריטוניאלי של דגי זברה סינגנטיים, וכיצד להשתמש בנתונים שהתקבלו כדי לקבוע את שכיחות התאים המפיצים את הגידול בתוך גידול נתון.

מחקרים נוספים המשתמשים בבעלי חיים שעברו שינוי גנטי עשויים לסייע בזיהוי המנגנונים השולטים בהתחדשות עצמית של תאי גידול אלו המפיצים את הגידול.