בחינת עיבוד הרשת המקומית באמצעות מגע Multi-אלקטרודה למינרית הקלטה

המטרה הכללית של הליך זה היא לתאר את המתודולוגיה שתאפשר לנו לבחון כיצד נוירונים בודדים ופוטנציאלי שדה מקומיים בשכבות קליפה שונות של קליפת המוח הראייתית הראשונית מקודדים מידע תחושתי. ההליך מתחיל בתיאור בניית מערכת המיקרו-דרייב (micro drive) הנשלטת במחשב והשימוש באלקטרודה למינרית בעלת מגעים מרובים להקלטה בקליפת המוח הראייתית הראשונית.

השלב הבא הוא ביצוע פרדיגמה של פוטנציאל תגובה מעורר לאחר שהאלקטרודה הוקדמה לאזור המטרה במוח. בעקבות זאת, נעשה שימוש בניתוח צפיפות מקור זרם כדי לזהות את השכבות הקורטיקליות על פי היפוך הקוטביות, בליווי קונפיגורציית מקור סנכרוני. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע מיפוי שדה קליטה וניתוח ההבדלים בפעילות העצבית בתגובה לגירוי חזותי.

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים ספציפיים לשכבות בקידוד מידע תחושתי. שלום, שמי שרה איגלמן ואני סטודנטית לתואר מתקדם בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס ביוסטון. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מערכי אלקטרודות מרובות, הוא שפרוק ה-U יכול להקליט פעילות עצבית לאורך מילימטרים רבים של קליפת המוח בו-זמנית בחדירה אחת.

שלום, שמי בריאן הנסן. אני סטודנט לתואר מתקדם העובד בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת טקסס ביוסטון. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, ולבחון אם וכיצד מידע מעובד באופן ספציפי לשכבות (laminar specific).

כדי להרכיב תחילה את מכלול הנעת האלקטרודה, רכזו את הכלים והחלקים הדרושים, כולל צינורות ההנחיה, תיל ההנחיה, מכשיר Dremel מלא, סט כלים וחלקים, ואת גשש ה-U. מדדו את צינורות ההנחיה כך שכאשר יחוברו למכשיר ההקלטה, יהיו ארוכים מספיק כדי להישען על הקשרה (dura) מבלי לגרום לה נזק. לאחר מכן, לאחר מדידת עומקה של תא ההקלטה, חתכו את צינורות ההנחיה לאורך הנמדד של כ-5 עד 7 סנטימטרים.

יש להקפיד ששברי מתכת לא יחדרו לתוך השפופרת. השתמש בחוט קשיח שקוטרו קטן מהקוטר הפנימי של שפופרת המוליך כדי להסיר שברי מתכת שנמצאים בתוך השפופרת. לאחר מכן, מקם את רשת השמות (name grid) בבסיס השמות (name base).

הדק את בורג התפס ואת בורג הרשת. לאחר מכן, זהה את אזור העניין (ROI) להקלטה ומקם את מגדלי המיקרו-דרייב מעל אזור זה. לאחר זיהוי אזור העניין, הזרג את צינור המוליך דרך תחתית הרשת עד שיהיה בבליטה של כ-1 עד 2 מילימטרים מחוץ לתא השם.

בשלב הבא, הרכיבו שני תפסים על כל מגדל הנעה מיקרוסקופי של ה-NA. מנוע מניע את התפס העליון, בעוד שהתפס התחתון יכול להיות מקובע במקומו או משוחרר. התפס העליון מחובר לצינור החיזוק של ה-U probe.

חברו את התפס התחתון לצינור ההנחיה ומרחו כמות קטנה של דבק מהיר (super glue) כדי לקבע את צינור ההנחיה במקומו. שני התפסים מספקים יציבות ודיוק למערכת. יישרו בזהירות את קצה גשש ה-U עם החלק העליון של צינור ההנחיה והשחילו את גשש ה-U דרך צינור ההנחיה עד שתוכלו לקבע את המגדל לבסיס הראשי.

כווננו את מיקום המגדל באמצעות בורג הלחיצה כך שלא ייווצר מתח נוסף על גשש ה-U או על צינור ההובלה. הניחו את מערכת ה-name על בסיס הגליל וחברו את כבלי המנוע למגדלים המתאימים. בשימוש במספר מגדלים, נעשה שימוש באזיקי פלסטיק מקודדי צבע כדי לסייע בהבחנה בין כבלי המנוע למגדלים; השתמשו בתוכנת ה-name כדי להתחיל בהקדמת גשש ה-U, בין אם על ידי הגדרת מיקום יעד שיקדם באופן אוטומטי את גשש ה-U לאותו מיקום, ובין אם על ידי לחיצה על ממשק תוכנת ה-name. הקדימו את גשש ה-U כך שלפחות 10 millimeters מקצה הגשש יעברו דרך צינור ההובלה אל מעבר לקצה תא ה-name.

סטריליזציה של אתר החשפה (U probe) תתבצע על ידי השكبתו בתמיסת אלדהיד פעילה ב-metro side למשך 20 עד 30 דקות לפני חיבור ה-name base לתא ההקלטה המשתיל. לאחר מכן, שטפו את ה-U probe ואת ה-name base במים סטריליים zero. הגדירו את מיקומי התוכנה (name software) על ידי נסיגה של ה-U probe כך שהקצה יהיה ממש בתוך צינור המדריך ב-name software.

לחצו על zero all positions. הצמידו את בסיס השם לתא ההקלטה המושתל והדקו את ארבעת הברגים. לאחר מכן, יישרו את הבסיס בהתאם לפין הנמצא בצדו של תא ההקלטה.

הדק שוב את ארבעת הברגים וודא שבסיס השם מחובר היטב לתא ההקלטה. כדי להתכונן להקלטה מתקדמת, גשושית ה-U מוארקת ונחשבת לצפה בהתאם להוראות ההארקה והייחוס. פעולה זו מבוצעת על ידי הצבת המגשר המחובר לחוט.

במחברים התחתונים, שלבי הראש (head stages) מקובעים למחבר של ה-U probe, ולאחר מכן מחוברים כבלי המגבר ומקבלים הארקה. את ה-U probe מקדמים בתחילה כ-1 עד 2 מילימטרים באופן מהיר וחזק. הגדירו את פרמטר המהירות בטווח של 0.1 עד 0.2 מילימטר לשנייה, ואת שלב העומק ל-0.2 עד 0.3 מילימטר.

ערכים אלו מבטיחים שגשוש ה-U יוכל לנקב את הקשיח (dura) בצורה נקייה, ומהווים שלב ראשון חשוב בהקלטה. לאחר החדירה דרך הקשיח, הפחיתו את המהירות ל-0.50 עד 0.1 מילימטרים לשנייה והפחיתו את צעד העומק ל-0.5 עד 0.1 מילימטרים. המטרה היא להקיד את גשוש ה-U בצורה חלקה ואיטית ככל האפשר, כך שלא ייגרם נזק לרקמה.

אחד הסימנים לכך שהגשוש (probe) חדר למוח הוא שינוי באמפליטודה של ה-LFP הנלווה להפחתה ברמת הרעש; כדי לוודא שהאלקטרודה משתרעת על פני כל השכבות הקורטיקליות, מדד את השינוי באמפליטודה בתגובה לגירוי של הבזק לבן בשדה מלא. השינויים באמפליטודה של ה-LFP לאורך זמן מהווים את הבסיס לניתוח פוטנציאל התגובה המעורר. ניתוח זה מספק את הבסיס לזיהוי השכבות הקורטיקליות.

מדוד את פוטנציאל התגובה המעורר במהלך משימת קיבוע פסיבית, בעוד הנבדק נחשף למסך שחור הממלא את השדה כולו, המהבז בלבן למשך 100 milliseconds ולאחר מכן חוזר לשחור. רצף זה מהווה ניסוי אחד, אשר חוזר על עצמו 200 פעמים. מעבד הרכישה הרב-ערוצי (plex) שומר את כל אותות הנתונים הרציפים ישירות למחשב ההקלטה באמצעות לוח National Instruments PCI.

לאחר שמירת הנתונים, התחל בעיבוד האותות לצורך ניתוח צפיפות מקור זרם. השתמש בתוכנת התיקון FP align המסופקת על ידי Plex כדי לתקן עיכובים בזמני אותות ה-LFP שנגרמו על ידי המסננים בבדי ה-head stages ובלוחות ההגברה המקדימה. בשלב זה, הנתונים מועברים ל-MATLAB באמצעות neuro explorer.

כל ערוץ LFP מסונן באמצעות מסנני מעבר גבוה ומעבר נמוך סטנדרטיים עם תדרי קיטוע של 0.5 hertz ו-100 hertz. לאחר סינון כל מגע של אלקטרודה, זהו כל ניסוי (trial) ובצע ממוצע בין הניסויים כדי לקבל את סדרת הזמן הממוצעת של ה-LFP עבור כל מגע של אלקטרודה, לאחר מכן ארגן כל מגע במטריצה שבה אמפליטודת ה-LFP היא פונקציה של הזמן, והפעל את ארגז הכלים ICSD ב-MATLAB על ידי הקלדת CSD plotter בסביבת העבודה (workspace). בהינתן שתדירות הדגימה של הנתונים הרציפים היא one kilohertz, הגדר את הפרמטר DT ל-one millisecond.

בשלב הבא, הגדירו את ערך המוליכות הקורטיקלית ל-0.4 Siemens per meter, המקרב את צפיפות מקור הזרם ביחידות של nano peers per cubic millimeter, ושנו את מיקום האלקטרודות כווקטור של 0.1 בצעד של 0.1 עד 1.6, שהוא מספר המגעים הכולל. לאחר הזנת כל הפרמטרים, לחצו על run this. צפו בפרופיל ה-CSD בממשק ה-CSD plotter והדביקו אותו באיור חדש.

ניתן להשתמש בפונקציות נפוצות ב-MATLAB, כגון image SC, כדי להוציא גרף של פרופיל השכבות, וניתן להחיל אלגוריתמי החלקה שונים ושגרות נורמליזציה לצורך ייצוג נתוני ה-CSD והשוואת זיהוי השכבות בין שעות ומפגשים שונים. כדי לזהות את היפוך הקוטביות הנלווה לקונפיגורציית sink source בבסיס שכבה ארבע, יש לאמת תחילה את נוכחותו של sink ראשוני בשכבה הגרנולרית. באמצעות פרופיל ה-CSD הלמינרי, אתרו בגרף ה-CSD את הקוטביות השלילית המונעת על ידי ה-sink.

לאחר מכן חשבו את מרכז המסה של כיור הגרגירים. מהניתוח מתקבל OID המורכב ממספר המגע והזמן שבו ה-sync היה הגדול ביותר. המגע עם ה-syn Centro משמש כנקודת הייחוס של שכבת הגרגירים באפס מיקרומטרים.

נתחו את כל המגעים שמעל ומתחת לרכס הייחוס וקבצו אותם לאחת משלוש השכבות האפשריות. Supra, granular, granular, ו-infra granular מאששים את ה-granular sink על ידי ערבוב מיקומי האלקטרודות, תוך השארת המישור הזמני ללא שינוי. לאחר הערבוב, מטריצת ה-CSD מחשבת את ניתוח ה-OID.

שוב, ערבוב של מגע האלקטרודות כפונקציה של עומק קורטיקלי אמור לבטל כל ספציפיות למבנה השכבות (laminar specificity). כדי למצוא שדות קליטה, התחילו בהצגת גירוי של קורלציה הפוכה (reverse correlation stimulus) על המסך במקום שבו שדות הקליטה עשויים להימצא. הגירוי מורכב מארבע דרגות אוריינטציה ב-45, 0, 90 ו-135 מעלות.

בצע ניתוח אשכולות (cluster analysis) על מפות קצב הפריקה כדי לאתר את השדה הקולט. ראשית, חשב את מיקומי קצב הפריקה המקסימלי ואת המרכז (centroid) שלהם עבור כל השהיית זמן. לאחר מכן, חשב את המרחקים בין ה-Centro לבין מיקומי קצב הפריקה המקסימליים הללו.

חשב מפות של קצבי פריקה בכל מיקום מרחבי עבור עיכובי הולכה שבין 40 ל-120 milliseconds במרווחים של חמישה millisecond עבור כל נוירון באופן בלתי תלוי. מצא את המרחק הכולל בין ה-OID לנקודות קצב הפריקה המקסימליות שסביבו בכל עיכובי הזמן. השדה הקולט נמצא בעיכוב הזמן שממזער מרחק זה.

לאחר מציאת שדה קליטה עבור כל תא, הציגו גירוי של קורלציה הפוכה הגדול מכל מיקומי שדות הקליטה המכסה את כל שדות הקליטה באוכלוסיית התאים שהוקלטה. ניתן להשתמש בגרף קצב פריקה בזמן אמת כדי לקבוע אם זוהו נכון מיקומי שדות הקליטה. לבסוף, מיינו את צורות גלי הספייקים באמצעות תוכנת המיון לא מקוון של Plexon, המבצעת קיבוץ של צורות גל על בסיס פרמטרים כגון רכיבים עיקריים, רוחב הספייק ומאפייני השפל והפסגה.

יש לוודא כי הוסרו יחידות סיגנל המגירות תגובות פתאומיות, ולהשאיר רק יחידות בעלות קצבי פריקה יציבים לצורך הניתוח המוצג כאן. כדוגמה להמחשת ניתוח ה-CSD באיתור שכבות קורטיקליות לאורך עומק הקורטקס כפונקציה של זמן, מיקומי השכבות הסופר-גרנולריות, הגרנולריות והאינפרה-גרנולריות נותרים יציבים גם ארבע שעות לאחר תחילת סבב ההקלטה. עקבי ה-CSD מייצגים את הממוצע של אותם מגעים שהוקצו לשכבה נתונה.

בדוגמה זו, השכבה הגרנולרית מראה ירידה ברורה באמפליטודת ה-CSD בערך לאחר 50 מילישניות. ניתוח קריטי נוסף בעת שימוש באלקטרודה הלמינרית הוא זיהוי ואיתור מדויקים של השדה הרצפטיבי של הנוירונים. נקודת המוצא של גרפים אלו היא נקודת הקיבוע, שהיא עיגול לבן קטן המוצג במרכז מסך מחשב שחור.

הצבע בגרפים אלה מייצג את קצב הפריקה של כל נוירון בתגובה לגירוי קורלציה הפוכה דינמי. איור זה מציג שתי דוגמאות של צורות גל של פולסים (spike waveforms) שבודדו באותו ערוץ. ניתוח אשכולות (Cluster analysis) בוצע באמצעות ניתוח רכיבים ראשיים ומאפייני צורת הגל של הפולסים.

צורות גלי ה-spike הממוצעות מוצגות בקו רציף. סטיות התקן מוצגות בקו מקווקו. בעת ביצוע הליכים אלה, חשוב לזכור להקדם את האלקטרודה בזהירות ולאפשר למוח זמן מספיק להתייצבות לאחר ההקדמה.

בדרך כלל אנו מתחילים בהקלטה כ-30 עד 45 דקות לאחר הקידום האחרון בעקבות הליך זה. ניתן להשתמש בטכניקות ספקטרליות אחרות, כגון LFP Power וסנכרון Spike Field, כדי לחקור את מבנה הרשת בתוך השכבות הקורטיקליות וביניהן.