זיכרון צורה פולימרים לתרבות התא הפעיל

המטרה הכללית של הליך זה היא לגדל תאים על תשתית בעלת טופוגרפיה המשתנה עם הזמן. הדבר מושג תחילה על ידי תכנות פולימר עם זיכרון צורה לצורה קבועה שניתן לזכור. לאחר מכן, הפולימר עם זיכרון הצורה מתוכנת לצורה זמנית, עליה נזרעים התאים בשלב מאוחר יותר.

השלב האחרון של ההליך הוא הפעלת הפולימר בעל זיכרון הצורה כדי שיחזור לצורתו הקבועה על ידי העלאת הטמפרטורה, ובסופו של דבר ניתן לקבל תוצאות המראות שינוי בהתנהגות התאים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שלום, שמי פט מאת'ר. אני פרופסור להנדסה ביו-רפואית וכימית ומנהל מכון הביומטריאלים של סירקיוז כאן באוניברסיטת סירקיוז.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני מכשירים מסחריים או מותאמים אישית למתיחת תאים הוא שבמערכת פולימרית אחת, אנו יכולים להחיל מגוון רחב של מאמצים מורכבים על התאים. שמי הוא Jay Henderson. אני מרצה בכיר להנדסה ביו-רפואית וכימית וחבר במכון לביומטריאלים של Syracuse.

שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה (Mechanobiology), כגון האופן שבו תאים מגיבים לשינויים דינמיים בסביבתם הפיזית. שמי קווין דייוויס ואני סטודנט לדוקטורט באוניברסיטת סירקוז במחלקה להנדסה ביו-רפואית והנדסה כימית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי ביולוגיה מכנית בדו-ממד (2D), ניתן להשתמש בה גם עבור מערכות אחרות, כגון פיגומים משני-צורה בתלת-ממד (3D) עבור הנדסת רקמות.

לפני תחילת נוהל זה, הכין תא הקשחה מותאם אישית באמצעות זכוכית למשטח (glass slide), ספייסר טפלון בעובי של 1 mm ולוח אלומיניום. אבטח את התא באמצעות תסניקי נייר קטנים. ראשית, הזרק NOA 63 אל תוך התא דרך חור בספייסר הטפלון באמצעות מחט במידה 18 gauge. לאחר מכן, הנח את התא על פלטה מחממת המכוונת ל-125 °C.

אפשרו לתא להתחמם לטמפרטורה אחידה במשך חמש דקות לאחר חימום התא. בצעו פולימריזציה של ה-NOA 63 למשך 20 דקות על ידי מיקום מנורת UV במרחק של 6.5 סנטימטרים מפני הזכוכית. הוציאו את ה-NOA 63 מהתא בעודו חם באמצעות להב תער.

לאחר מכן, בצעו ריפוי לאחר-מעבדה (post cure) של פולימר זיכרון הצורה תחת אור UV למשך שלוש שעות ו-40 דקות, ישירות על לוח חימום בטמפרטורה של 125 degrees Celsius. כדי לאפיין את זיכרון הצורה של ה-NOA 63, הכינו דגימה בצורת דמב elenco על ידי דחיסה חמה של הסרט המרופא באמצעות מחץ מותאם אישית. לבסוף, התקינו את הדגימה באנליזה מכנית דינמית (dynamic mechanical analyzer) עם מתקן מתיחה.

הגדירו את המכשיר למצב בקרת כוח ותכננו את הליך הבדיקה כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב המצורף לסרטון זה. תוצאת ההליך היא סרט פולימר בעל זיכרון צורה (SMP) שעבר הקשיה איזותרמית. הניחו את ה-CSMP על פלטה חמה והגדירו טמפרטורה הגבוהה מטמפרטורת מעבר הזכוכית כדי להפחית את המודול ולהקל על החיתוך. להכנת דגימות בודדות מסרט ה-SMP שהוקשח באופן איזותרמי.

חתוך את סרט ה-s and p באמצעות תער לגודל הדגימה הרצוי. ניתן לקבע את הצורה הזמנית במספר דרכים שונות. כאן, נעשה שימוש במכבש הידראולי שולחני עם פלטות שניתן לחמם ולקרור כדי להטביע טופוגרפיה זמנית.

ראשית, הגדירו את הטמפרטורה של ה-PLAs לטמפרטורה גבוהה מה-tg. לצורך הדגמה זו, נוצר מבצע (embosser) על ידי הקשחה של אפוקסי על גבי תקליט ויניל כדי להפיק צורה זמנית של חריצים מקבילים. ניתן להכין את המבצע מחומרים אחרים ובעלי טופוגרפיות שונות, אך עליו להיות קשיח יותר מה-NOA 63.

בטמפרטורת ההטבעה, הניחו את דגימות ה-s וה-p כשהפנים כלפי מטה על המטבע. לאחר מכן, הכניסו את הדגימות ואת המטבע למכבש. הפילו עומס מוקדם של כ-100 kilo pascals כדי ליצור מגע בין ה-PLAs המחממים לבין הדגימות, והמתינו כחמש דקות כדי לאפשר לדגימות להגיע לטמפרטורה אחידה.

לאחר הגעה לטמפרטורה אחידה, יש להפעיל לחץ של 1 עד 6 megapascals על הדגימות ולהמתין למשך דקה אחת. ה-SMP יישבר. אם יופעל מאמץ גדול יותר.

הפעילו מאמצים קטנים יותר כדי ליצור טופוגרפיות עם אמפליטודות קטנות יותר. לאחר הפעלת הלחץ, הפחיתו את הטמפרטורה אל מתחת ל-TG באמצעות יכולת קירור המים של לוחות המכבש. כאשר הטמפרטורה נמוכה מה-tg, הסירו את הכוח המופעל לפני תחילת ניסוי תרבית התאים הפעילה.

השתמשו באור ה-UV של קבלי הבטיחות הביולוגית כדי לעקר את הדגימות. סדרו את הדגימות כשהן פונות כלפי מטה בצלחונות סטריליים ללא מכסים, והפעילו את אור ה-UV למשך שש שעות. לאחר מכן, העבירו את הדגימות לצלחונות סטריליים חדשים כאשר הן פונות כלפי מעלה.

הדליקו את פנס ה-UV למשך שש שעות נוספות. הדגימות צריכות להגיע למצב שיווי משקל יציב יחסית לפני הזריעה עם תאים. העבירו את הדגימות לפלטת 96 בארות והוסיפו 150 microliters של מצע גידול מלא.

מדיום לכל באר. הניחו את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 30 °C עם 5%CO2 עד להשגת התאוששות חלקית רצויה. לצורך הדגמה זו, הדגימות דגרו למשך 30 שעות כדי להפיק אמפליטודה גדולה מספיק ליישור התאים.

לאחר שהושגה התאוששות חלקית, ניתן לזרוע את הדגימות עם תאים. העבירו את הדגימות לפלטה חדשה בעלת 96 בארות. לאחר מכן, הוסיפו 150 microliters של תמיסת תאים לכל אחת מהדגימות כאן, C3 H 10 t וחצי.

מרבית הפיברובלסטים העובריים משמשים בריכוז של 20,000 תאים למיליליטר. כדי להשיג תאים מבודדים, יש לאפשר לתאים להיקשר ולהתפשט על גבי הטופוגרפיה הזמנית על ידי דגירה ב-30 °C למשך 9.5 שעות. לאחר מכן, יש לבחון את מורפולוגיית התאים לפני המעבר על ידי הסרת דגימות וביצוע צביעה והדמיית פלואורסצנציה של הדגימות.

חומר זה מציג פלואורסצנציה עצמית לאורך רוב טווח ה-UV והטווח הנראה; מומלץ להשתמש בفلואורופורים מקצה הספקטרום האדום הרחוק, כגון Alexa Fluor 647, כדי להפחית את הרקע. כדי לאפשר לדגימות להתאושש, העבירו את הפלטה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C והמשיכו בטיפוח למשך 19 שעות. הדבר מאפשר לחומר להתאושש ולתאים להתאים את המורפולוגיה שלהם לטופוגרפיה החדשה. לאחר האינקובציה, יישמו את הצבעים המתאימים, כגון פאלוֹיִן (phalloidin) לצילום של אקטין פילמנטרי.

כשלב סופי, ניתן לדגמן את התאים על הטופוגרפיה החדשה; מוצג כאן זיכרון צורה חד-כיווני של NOA 63 cured בודד. הפעולה חזרוה שלוש פעמים, כאשר הכוכבית מציינת את תחילת הריפוי הניסיוני. NOA 63 הוא מוצק זכוכיתי שקוף בעל תכונות זיכרון צורה מצוינות.

במקרה זה, החומר עבר פילמור ומציג TG אחיד של 51.1 degrees Celsius, כפי שנקבע על סמך תחילת הירידה במודול האחסון. הירידה במאמץ הנצפית כאן מתרחשת ב-tg הנמדד. אחוז גבוה מהמאמץ שהופעל, 4.7%, נקבע לאחר פריקה בטמפרטורה של 20 degrees Celsius, מה שמתבטא ביחס קיבוע של 89.3%. המאמץ הקבוע שוחרר לאחר מכן ביחס של 84.4% בטווח טמפרטורות קטן יחסית במהלך החימום.

ביצועי זיכרון הצורה לא הראו התדרדרות עד לשלושה מחזורים, כפי שניתן לראות מכך שכל העקומות עקבו כמעט בדיוק אחרי אותו נתיב. האמפליטודה של הטופוגרפיה הזמנית פוחתת עם הזמן בטמפרטורה של 30 degrees Celsius לאורך 30 שעות. בטמפרטורה של 30 degrees Celsius.

האמפליטודה הופחתה בכ-50% כפי שמוצג כאן בזמן אפס. היא פוחתת ב-10% נוספים במהלך 9.5 השעות הבאות. כאשר ההתאוששות מופעלת על ידי העלאת הטמפרטורה ל-37 °C, האמפליטודה פוחתת ל-0.5% מהאמפליטודה הראשונית בתוך 9.5 שעות עבור המכבש שנעשה בו שימוש ומאמץ הבלטה של 4.9 megapascals.

זהו שינוי תפקודי מחריצים של 13 מיקרומטר למשטח שטוח כמעט לחלוטין. פולימר זה מתאושש בטווח טמפרטורות של 30 עד 37 מעלות בתנאי תרבית תאים. הדבר נובע own ספיגת מים ממצע התרבית; המים מרככים את הפולימר, מה שמוריד את ה-tg ומאפשר התאוששות בטמפרטורות הנמוכות מה-TG היבש של 51 מעלות.

דוגמה להתנהגות תא הנשלטת באמצעות שימוש במצעי תרבית תאים פעילים היא שינוי בארגון השלד התאי על גבי מצעים חריצים זמניים. לפני הפעלת ההתאוששות, סיבי האקטין מסתדרים לאורך כיוון החריצים. לאחר התאוששות באמצעות העלאת הטמפרטורה, סיבי האקטין עוברים ארגון מחדש והם מכוונים באופן אקראי.

לעומת זאת, דגימות ביקורת בעלות חריצים סטטיים, שטוחים או סטטיים אינן עוברות ארגון מחדש לאחר העלייה בטמפרטורה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שניתן להתאים את הגיאומטריה של תא ההקשיה, טמפרטורת המעבר של הפולימר, שיטת קיבוע המעוות וההרכב של הפולימר עצמו, כדי להשיג את המעבר הרצוי בניסוי שלכם בעקבות ביצוע פרוצדורה זו. ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון real time PCR, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו למשל כיצד ביטוי גנים משתנה בתגובה לגירוי המכני מהמצע לאחר פיתוחו.

טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום המכנו-ביולוגיה של התא לחקור את השלד התאי, את ארגומיו מחדש ואת פיזיקת החומר הרך בממד שני. תודה על התעניינותכם בעבודתנו ותודה שצפיתם.