Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

מטרת ניסוי זה היא לחקור את הארגון העצמי של פעילות מוחית בריאה למפולות נוירונליות (neuronal avalanches), המהוות את סימן ההיכר של דינמיקת מצב קריטי בקורטקס. דבר זה מושג על ידי שילוב של פרוסה קורונלית של קורטקס שכבתי יחד עם פרוסת מוח בינוני, המספקת קלטים דופמינרגיים החשובים להתפתחות הקורטקס. כשלב שני, תרבית השיתוף (co-culture) של הקורטקס והמוח הבינוני גודלה על מערך אלקטרודות רב-נקודתי (multi electrode array), המאפשר גירוי והקלטה של פעילויות נוירונליות ממספר אתרים בתרבית.

בשלב הבא, אנו מאפשרים לתרבית המשולבת להשתטח, להתרחב ולהיקשר לפני השטח של ה-MEA במהלך השבועיים הראשונים בתוך אינקובטור בעיצוב מותאם אישית, המעביר את התרבית במחזורי חשיפה לאוויר רגיל ולתרבית. התוצאות הנוזליות מראות ארגון עצמי ספונטני של פרצי פוטנציאל שדה מקומיים סבממקומיים-זמניים לכדי מפולות נוירונליות. הדבר מבוסס על הקלטות MEA וניתוח מפולות במצב offline המזהה את חוק החזקה בגדלי המפולות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תרביות מפוזרות (dissociated cultures), הוא ההיבט של מדעי המערכות והנוירוסיינס. אנו יכולים לגדל בתרבית משותפת (co-culture) אזורי מוח רבים יחד, ותרביות רב-אזוריות אלו מבססות ארגון מוחי נכון בקנה מידה גדול, כגון השכבות הקורטיקליות ומערכות ההקרנה. יישומיה של טכניקה זו חורגים מעבר ללימוד של מפולסות נוירונליות (neuronal avalanches).

לדוגמה, ניתן לחקור את התגובה לגירוי ברמת הרשת תחת תנאי in vitro מבוקרים במדויק. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן קשה ללמוד את היישום הנכון של תערובת הפלזמה-thrombin ואת מיקום הרקמה על ה-MEA. שלבים אלו דורשים תזמון נכון, מפל טמפרטורה מתאים, והימנעות ממגע ישיר עם פני השטח העדינים של ה-MEA.

כדי להכין תא זכוכית סטרילי הניתן לאטימה לצורך הקלטות, ראשית חתוך גלילי זכוכית בעלי הברגה עם מכסה פלסטיק מטפלון, במרחק של כשני מילימטרים מתחתית ההברגה. אלו נחוצים לסגירה מאובטחת ואטומה של תא התרבית. לאחר מכן, נקה את טבעות הזכוכית על ידי שטיפה במים שלוש פעמים, ואז הרתחה למשך חמש דקות ב-200 proof ethyl alcohol.

הניחו להם להתייבש בצד; נדרש תמיסת סיליקון כדי להצמיד את טבעות הזכוכית למשטח ה-MEA. השתמשו בערכת אלסטומר סיליקון cell guard 180 4 וערבבו היטב 15 milliliters של חלקים A ו-B. לאחר מכן, המתינו 15 דקות כדי להוציא בועות אוויר.

הפרידו את התמיסה ל-1 mL ב-Eloqua, ואחסנו בטמפרטורה של 20°C- לשימוש עתידי. כעת הדביקו טבעת זכוכית ל-MEA על ידי שאיבת 1 mL של סיליקון בטמפרטורה של 23°C למזרק עם מחט בעלת gauge קטן ומריחתו על משטח החיתוך הבלתי מלוטש של טבעת הזכוכית. לאחר מכן מרכזו את טבעת הזכוכית על ה-MEA ומרחו שכבה נוספת של סיליקון מסביב לחלק החיצוני של הטבעת כדי להבטיח איטום חזק יותר.

השאירו את התערובת להתייבש במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורה של כ-60 degrees Celsius על פלטה מחממת. לאחר מכן, סטריליזו את תא ה-MEA ואת מכסי התא תחת מ这篇文章 flow hood על ידי שטיפה של שלוש פעמים במים דה-יוניים ולאחר מכן שלוש פעמים באלכוהול 70% עבור השטיפה האחרונה. השאירו את התא למשך 10 דקות באלכוהול.

לאחר מכן, חשוף את פנים התא והמכסה לאור UV למשך 10 דקות. בצע עיקור באוטוקלאב בטמפרטורה של 120 °C למשך 45 דקות. לאחר העיקור, הנח להם להתייבש.

כעת יש לצפות את פני השטח של ה-MEA בתוך תא התרבית ב-poly D lysine. ה-meas החדשים המשמשים בניסוי זה הם ליפופיליים למדי, לכן יש לצפות אותם באמצעות טפטוף חוזר. יש לבצע שאיבה של התמיסה מרשת האלקטרודות.

חברו את הפקק כדי לאטום את תא ה-MEA לאחסון ולשימוש עתידי. פרוצדורה זו מניבה חתכים של קורטקס ו-VTA עבור כ-12 תרביות משותפות (co-culture), ויש לבצעה בתוך מ(), תחת תנאים סטריליים תוך שימוש בבעלי חיים בריאים בני יום עד יומיים לאחר הלידה; הזמן הכולל לאיסוף הרקמה צריך להיות פחות משעה אחת. לאחר עריפת הראש, התחילו בהוצאת המוח על ידי ביצוע שני חתכי מספריים לצדדים כדי להסיר את העור מהקרקפת.

הסר ולאחר מכן פתח את הגולגולת באמצעות מספרי עיניים עדינים, על ידי ביצוע חתך אחד סגיטלי במרכז וחתך קורונלי אחד בחיבור שבין הקורטקס למוח הקטן. הרחק את ארבעת שלחוני הגולגולת הללו כדי לחשוף את המוח. לאחר מכן, באמצעות שפכטל מחודד, בצע חתך פרונטלי דרך הבצול האופולקטורי.

לאחר מכן, החלק את השפכית בארבעה כיוונים מתחת למוח. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת והנח לו להחליק לתוך תמיסת גלדה מקוררת לקירור מהיר ולאחסון זמני.

חזור על הפרוצדורה לעיל עבור שני מוחות נוספים. כדי להשיג רקמה מה-VTA, העבר את המוחות לצלחת פטרי סטרילית ויבשה. בעזרת שפכטל קטן, הסר נוזלים עודפים על ידי החלקת כל מוח בעדינות הצידה למשך כסנטימטר אחד.

לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח כדי להסיר את גזע המוח על ידי ביצוע חתך קורונלי אנכי בגובה המוחון. כעת, הדבק בלוק אגר על דיסק קיבוע לצורך ייצוב מכני של המוחות במהלך הליך החיתוך. לאחר מכן, מרח פס דק של דבק מהיר, מספר מילימטרים לפני בלוק האגר על הדיסק, תוך שימוש במרית קטנה כדי למנוע מהדבק לגעת באגר.

העבירו והצמידו כל מוח כאשר הקוטב הפרונטלי (frontal pole) פונה כלפי מטה. ודאו כי הקטבים הפרונטליים מודבקים לדיסק ההצמדה וכי הצדדים הוונטרליים נוגעים באגר ללא שאריות דבק. פעולה זו מבטיחה ייצוב מכני תקין במהלך החיתוך והרמה קלה של הפרוסות החתוכות.

בשלב הבא, טבלו בזהירות וקבעו את דיסק ההרכבה עם המוחות המורכבים במגש ויברציה המלא בתמיסת גאז (gaze) מקוררת. לאחר מכן, באמצעות להב תער שנקי בזהירות, חתכו חתכים קורונליים בעובי 400 micrometer של המוח האמצעי בתדר הרטט הגבוה ביותר ובמהירות התקדמות נמוכה יחסית; באמצעות פיפטת פסטה הפוכה עם נורת יניקה, אספו והעבירו את הפרוסות המכילות את ה-VTA אל צלחות פטרי בגודל 35 על 10 millimeter המלאות בתמיסת גאז סטרילית ומקוררת עבור חתכי קורטקס. חזרו על שלבי החיתוך הקודמים, אך בצעו חיתוך אנכי בין הקורטקס למוח הקטן (cerebellum) והרכיבו את ארבעת המוחות כאשר הקוטב הפרונטלי פונה כלפי מעלה.

אספו כ שלושה חתכים קורונליים בעובי 350 micrometer החל מגובה הסטריאטום. כעת, באמצעות סכין מיקרו העשויה מלהבי תער שבורים, בצעו דיסקציה של חתכים קורונליים ברוחב של כ שני מילימטרים של קורטקס פרונטלי ואזורי הגב המוחיים המכילים את ה-VTA תחת מיקרוסקופ סטריאו. אספו את נתחי הרקמה בנפרד לצלוחיות קטנות המלאות בתמיסת gaze מקוררת.

כדי להתחיל בהצבת הרקמה במיקום הראשון של תא ה-MEA, מקמו את ה-MEA בטמפרטורה של החדר תחת מיקרוסקופ סטריאו כאשר מערך האלקטרודות נמצא בפוקוס. לאחר מכן, מרכזו טיפה של 25 µL של פלסמה על מטריצת מערך האלקטרודות הנקייה, ללא אבק וסטרילית. באמצעות שפכטל קטן, החליקו בזהירות נתח של קורטקס ו-VTA אל תוך טיפת הפלסמה.

כעת הניחו את ה-MEA על פלטת קירור וכווננו מחדש את המיקוד. המתינו לקירור למשך כ-15 שניות לפני הוספת 25 µL של thrombin אל טיפת הפלזמה. לאחר מכן, בעזרת טיפ הפלסטיק של ה-thrombin, פזרו בזהירות את תערובת הפלזמה וה-thrombin על פני ה-MEA בתנועות סיבוביות קטנות.

יש להיזהר לא לגעת ישירות במערך האלקטרודות השביר. לאחר מכן, יש להניח בעדינות את הקורטקס על המערך, כאשר הגבול הדורסלי נמצא לאורך שורת האלקטרודות השנייה של המערך. באופן זה, השכבות השטחיות המתפתחות יכסו בסופו של דבר את שאר המערך.

לאחר מכן, מקמו את ה-VTA בסמוך לגבול הוונטרלי של חתך הקורטקס. כעת, כסו וסגרו באופן רופף את תא ה-MEA כדי לשמור על לחות גבוהה. השאירו את מכלול תרבית ה-MEA למשך כשישה דקות בתוך המנדף בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לטרומבין שבפלסמה להקריש.

בינתיים, חזרו על הפרוצדורה כדי להכין שלושה תרביות נוספות. לאחר מכן, הוסיפו בזהירות טיפות קטנות של 600 microliters של מצע גידול לתאי התרבית, באמצעות מזרק של 1 cc עם מחט בכיול 25 על 5/8.

לאחר יומיים, in vitro, יש להוסיף 10 µL של מעכב מיטוזה. לאחר מכן, יש לרענן 60% ממצע התרבית ביום הרביעי ל-in vitro וכל ארבעה ימים לאחר מכן. במהלך הגדילה הרגילה, התרבית תהפוך שטוחה באופן משמעותי ותתרחב מעט גבית.

בשל התפתחותן של השכבות הקורטיקליות השטחיות, תרבית בריאה מזוהה לפי רקמה אטומה בגוון אפור בצפייה במיקרוסקופ שדה בהיר (brightfield). לעומת זאת, שלפוחיות מחזירות אור ובהירות, המאפיינות תאי ניוון מתים כ-10 עד 12 ימים לאחר הכנת התרביות, מעידות על כך שהן מוכנות להקלטה ולגירוי. כדי להתחיל בסשן הקלטה, מעבירים את ה-MEA ממגש האחסון אל ראש ההקלטה.

להקלטת פוטנציאל שדה מקומי או LFP, השתמשו במסנן מעביר פס של 1 עד 200 hertz. ניתן לחקור גם פעילות רב-יחידתית (Multiunit activity) באמצעות מסנן מעביר פס של 300 עד 3000 hertz. פעילות ספונטנית בריאה נוטה להתרחש בפרצי גליות (bursts) בגדלים ובמשכים שונים.

כדי לחקור את הקשר בין ה-LFP לבין פעילות היחידה, ניתן לחשב ממוצעים של LFP המופעלים על ידי פריקה (spike triggered averages). עבור תרביות קורטקס אלו, סטיות שליליות של ה-LFP נמצאות במתאם עם פריקה נוירונלית לצורך רישום פעילות המושרה על ידי גירוי. ראשית, צורת הגל הזמנית ואמפליטודת הגירויים נקבעים באמצעות תוכנה השולטת במחולל גירויים.

פרוטוקול גירוי יעיל הוא מתן שוק בודד עם מטען ניטרלי בשליטה זרמית ובצורת גל מרובע דו-קוטבי. לאחר מכן, נבחרת אלקטרודה שתשמש להעברת הגירויים. תגובות LFP שנוצרו מהגירוי נראות בדרך כלל דומות להתפרצויות של פעילות ספונטנית.

מעגלי חסימה (Blanking circuitry) מנתקים את המגברים במהלך הגירוי כדי להפחית ארטיפקטים של גירוי ולמנוע רוויה של המגבר. אלקטרודת הגירוי דורשת מספר שניות כדי להתאושש מהגירוי, ולכן לא ניתן להשתמש בה להקלטת פעילות תגובה. ב-MEA נוטים להופיע צבירים מרחביים-זמניים (spatiotemporal clusters) עם פעילות באלקטרודה אחת, שלעיתים קרובות מלווה בפעילות באתרים אחרים.

במקביל, מוצגים כאן צורות גל טיפוסיות של ה-LFP במהלך תקופות פעילות אלו, על ידי הצבה חופפת של שלושה אשכולות המתרחשים במרווחים של מספר שניות עבור כל אשכול. ניתן לראות סטיות LFP שליליות במספר אלקטרודות בתוך חלון זמן של שנייה אחת; בעת חילוץ שיאי NLFP החוצים סף של מספר סטיות תקן (sd) שליליות, הפעילות בצורה של זמני שיאי NLFP מוצגת בצורה נוחה ב-Rasta, שבה עמודות של נקודות מייצגות NPS כמעט סינכרוניים באלקטרודות שונות. הארגון המרחבי-זמני של פעילות זו הוא מורכב למדי.

עמודות שנראות הומוגניות פחות או יותר ברזולוציה זמנית נמוכה, מורכבות מצבירים נפרדים ברזולוציה זמנית גבוהה יותר, וכן הלאה. הופעתם של מרחב, צבירים GEOTEMPORAL ו-LFP היא מאורגנת מאוד ברשתות קורטיקליות. באופן ספציפי יותר, הארגון הוא בלתי תלוי קנה מידה (scale invariant) עבור מפולות נוירונליות.

הדבר מודגם על ידי חישוב ההסתברות של גדלי צבירים ברזולוציה זמןית נתונה, Delta T. כאן הצבירים מורכבים מ-NL FPS המתרחשים באותם מקצבי זמן או במקצבים עוקבים; כאשר גודל צביר כזה מבוטא במספר הכולל של NFPS לצביר או באמפליטודות NLFP משולבות לצביר, התפלגויות גודל הצבירים חושפות חוק חזקה עם מעריך קרוב ל-1.5-. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו יש להוציא בזהירות רקמות מוח ולגדל תרביות על מערכי אלקטרודות רב-נקודתיות (multi electrode arrays) במטרה לחקור את הארגון העצמי של פעילות נוירונלית.

שיטות אלו שימשו גם לחקר הקשר בין פעילות ספונטנית לבין פעילות המעוררת על ידי גירוי ברשתות קורטיקליות.