ג'ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לשנות את הביטוי הגנטי בתוך מערכת העצבים המרכזית העוברית של הנוירונים. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת נקבות בהריון בתזמון מוגדר והכנתן לניתוח. לאחר מכן, קרני הרחם נחשפות באמצעות ביצוע חתך בבטן.

לאחר חשיפת העוברים, מזריקים DNA לתוך הפרוזדור הצדי, הפרוזדור השלישי או המרווח הסוב-רטינלי. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הפעלת זרם חשמלי על העובר דרך דופן הרחם, תוך הכוונת אלקטרודות המשטח כך שהקטב החיובי ימוקם מעל האתר המועדף לטרנספקציה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות התרבות, נדידה ודיפרנציאציה של תאי מוצא עצביים ב-tline kelon dying kelon וברשתית באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דגנרציה של עכברים טרנסגניים, הוא שהיא מהירה, מאפשרת מחקרים בעלת תפוקה גבוהה יותר ובעלת עלות נמוכה יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ההתפתחות העצבית, כגון אילו גנים מווסתים תאי אב עצביים, שגשוג תאים, קביעת גורל התא, דיפרנציאציה נוירונלית ונדידת תאים. ההשלכות של טכניקה זו עשויות להוביל להבנה טובה יותר של המסלולים הגנטיים העומדים בבסיס פגמים בהתפתחות ה-CNS, שרבים מהם גורמים לליקוי קוגניטיבי ולהפרעות התנהגותיות בבני אדם, מעבר לתועלתה בהבנת התפתחות מערכת העצבים המרכזית.

ניתן ליישם טכניקה זו גם על מערכות איברים אחרות, כגון מערכת העצבים ההיקפית המתפתחת, הלב והשילייה. ניתן להשתמש בה גם לחקר מודלים של מחלות בעכברים וכן באורגניזמי מודל אחרים כגון אפרוחים ו-xip. באופן כללי, המכשול העיקרי להצלחה עבור המשתמשים בטכניקה זו בפעם הראשונה הוא הישרדות העובר; יש לנקוט משנה זהירות בעת הטיפול, ההזרקה והעיבוד של העוברים.

הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר נזקקנו לאמצעי מהיר למניפולציה של ביטוי גנים בעובר, בטלנצפאלון וברשתית. פיתחנו טכניקה זו במעבדתנו על ידי התאמה של השיטה שתוארה במקור על ידי Sal, ופורסמה בכתב העת Developmental Biology בשנת 2001. עבדנו בנוסף עם מעבדה שותפה כדי לבסס פרוטוקול זה גם ב-dilon מתפתח.

ההדגמה הוויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן את שלבי ההזרקה והאלקטרופורציה קשה ללמוד מאחר שהם דורשים מניפולציה זהירה מאוד של העוברים, ואתרי ההזרקה עשויים להיות קטנים מאוד לעיתים. לדוגמה, החלל הסוב-רטינלי (subretinal space). מי שידגים את הפרוצדורה היום הוא Rajiv, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה של Sherman. כדי להתחיל, יש לנקות ולסטריליזציה את כל כלי הניתוח. לאחר מכן, מלאו מזרקים בתמיסת סלין ובתמיסת lactated ringer והניחו אותם על פד חימום כדי לחממם אותם באזור הניתוח.

עקרו פד חימום בעזרת 70% ethanol, ולאחר מכן כסו אותו ברפידה סטרילית של גזה ללא סיבים. כוון את פד החימום ל-37 degrees Celsius. הניחו את בעל החיים בתא הרדמה קטן והרדימו אותו על ידי הזרמת 5% isof fluorine עם חמצן בקצב של one liter per minute דרך מאייד.

יש לוודא כי פליטת ה-isof fluorine נאספת באמצעות מערכת שאיבה. ברגע שנשימת בעל החיים הופכת עמוקה וסדירה, הוצאו אותו מהתא. השתמשו בבדיקת צביטה באצבע ובבדיקת רפלקס מצמוץ העין.

כדי להבטיח הרדמה מלאה, הנח את החיה המורדמת על בטנה והשתמש בצינור נשמה להגשת 2.25% isoflurane במהלך הניתוח. הזרק buprenorphine בריכוז של 0.1 mg/kg ממשקל הגוף תת-עורית בעורף.

המשיכו לעקוב אחר נשימת בעל החיים וכווננו את זרימת ה-isof fluorine במידת הצורך. לאחר מכן, הדביקו סרט דביק על חזה בעל החיים המורדם ובדקו שוב את תגובת הנסיגה על ידי צביטה של כף הרגל האחורית באמצעות פינצטה קהה. בעזרת מקלון צמר סטרילי, מרחו שכבה עבה של קרם d על הבטן, תוך וידוא שפרוות התחתית מכוסה לחלוטין.

השאירו את הקרם למשך כשלוש דקות ובדקו מדי פעם אם השערות הוסרו. בעזרת מקל swabs סטרילי, הרטיבו רפידת גזה סטרילית במים סטריליים ונגבו את השערות מהבטן. לאחר מכן, סטריליזו את אתר החתך באמצעות כלורהקסידין ומים נוספים.

ייבשו את הבטן בעזרת גזה סטרילית נקייה. חזרו על שלב זה עם 70%ethanol תוך שימוש בגזה כסמנית סטרילית טרייה. התכוננו לניתוח על ידי לבישת לבוש כירורגי כדי לחשוף את קרני הרחם.

ראשית, אתרו את ה-linea alba כקו עמום מתחת לעור בקו האמצע. בעזרת פינצטה, הרחיקו את העור מדופן הבטן ובצעו חתך ישר קטן ממערב הבטן כלפי מטה באמצעות מספרי עור, פינצטה מעוקלת ומספריים. חזרו על התהליך עם הפריטונאום. אחזו בפריטונאום בעזרת הפינצטה.

הרחיקו את הרקמה ובצעו חתך שגודלו מספיק כדי למשוך דרכו את הרחם. הניחו גזה סטרילית עם חריץ אנכי קטן מעל החתך והרטיבו אותה בתמיסת סליין סטרילית חמימה. לאחר מכן, החליקו את הפינסטה לתוך החתך ואתרו את הרחם תוך כדי החזקת החתך פתוח באמצעות הפינסטה.

אחזו ברחם בין שני העוברים הגלויים הראשונים ומשכו את שני צדי קרני הרחם אל הגזה. ספרו את מספר העוברים וסמנו כל ספיגה (resorption) או עוברים בעלי גודל גוף קטן. כדי להכין את המספר הנכון של הזרקות DNA, הרטיבו את קרני הרחם בתמיסת סלין והחזירו בזהירות קרן רחם אחת אל תוך הבטן.

כדי לטעון את המחטים הכירורגיות, השתמשו בפיפט מסוג pulled past up עם פיה מחוברת כדי לשאוב 10 µL של תמיסת DNA נטולת אנדוטוקסינים בריכוז 3 mg/mL המכילה צבע מתיל גרין (methyl green), והשליטו את ה-DNA אל תוך מחט כירורגית. הרכיבו את המחט המלאה הראשונה על המיקרו-מניפולטור.

עמדו לצד המזרק והתחילו עם העובר הקרוב ביותר לשחלה. השתמשו בפינצטה עגולה כדי לסובב בעדינות את העובר בתוך הדצידואה (decidua) כך שיהיה ממוקם פנימה, באופן המאפשר הזרקות בכיוון של גליל ROS לעבר השרוול (cordal direction). השתמשו במקור אור סיב אופטי כדי לזהות את קו האמצע של המוח העוברי.

שימו לב לחדרים הצדיים הגדולים המקיפים את האזורים הרוסטרליים. החזיקו את העובר במקומו באמצעות פינצטה קמורה ומקמו את המחט הכירורגית הממולאת מעל הרחם, כך שזווית הכניסה למוח תהיה כ-45 מעלות. בתנועה מהירה ויציבה, סובבו את החוגה של המיקרו-מניפולטור כדי להחדיר את קצה המחט דרך דופן הרחם ואל תוך החדר הצדי של מוח העובר.

בשלב הבא, לחצו על דוושת המיקרו-מזרק. כדי להזריק את תמיסת ה-DNA, ניתן לזהות הזרקה מוצלחת בקלות על ידי התפשטות צבע המתיל גרין (methyl green) בתוך חדרי המוח העובריים. כעת, לאחר שה-DNA הוזרק, משכו את המחט לאט למעלה כדי להוציאה מבלי לגרום לשבירה.

הנח את העובר המוזרק על גזה סטרילית והרטה היטב במי מלח חמימים. אחז את הרחם כאשר הקוטב החיובי של אלקטרודת המגף מונח על האתר הרצוי לטרנספקציה. לאחר מכן, הגש חמישה פולסים חשמליים ריבועיים של 40 עד 50 volts ו-50 milliseconds בקצב של פולס אחד לשנייה.

כסו את העובר שהוזרק ועבר אלקטרופורציה בגזה רטובה להגנה, ולאחר מכן המשיכו להזרקה לעובר הבא. עם סיום ההזרקה והאלקטרופורציה של כל העוברים הרצויים בקרן הרחם, דחפו אותה בזהירות חזרה אל חלל הגוף. הוציאו את קרן הרחם השנייה כדי להתחיל בהזרקה ובאלקטרופורציה של שאר העוברים.

לאחר שכל העוברים הוחזרו אל תוך הרחם, יש להוסיף שני עד שלושה מיליליטרים של סליין חמים לחלל הבטן, ולאחר מכן להסיר את הגזה מהבטן כדי לחשוף את דפנות הפריתנאום. השתמש בחוט משי שחור קלוע כדי לתפור את הפריתנאום, על ידי עיגון החוט בפריתנאום הקרוב ביותר לסטרנום והמשך התפירה הרחק מהעיגון. ודא שכל התפרים מהודקים וששום איבר פנימי או עור לא נתפרו לתוך הפריתנאום.

גזרו את שאר קו התפר והשליכו אותו. משכו את העור לסגירה מעל קו התפר באמצעות פינצטה תוך שימוש בסיכות לסגירת עור. הצמידו את העור בסיכות תוך הקפדה לא להסיך את קו התפר שמתחתיו ולא למתוח את העור חזק מדי.

עם סיום הפעולה, ודאו שהסיכות הדוקות על ידי לחיצה עדינה יחד באמצעות כלי התפירה כאן, A-P-C-I-G שני וקטורי ביטוי המניעים את ביטוי ה-GFP הועברו באלקטרופורציה לתוך הנאו-קורטקס (neocortex) המתפתח ביום העובר E 12. ככל שהתפתחות הנאו-קורטקס מתקדמת, הפרוגניטורים האפיקליים (apical progenitors) מבדילים את עצמם לפרוגניטורים בסאליים משניים (secondary basal progenitors) או לנוירונים פוסט-מיטוטיים וממשיכים לבטא GFP. תאים עצביים אלו ניתנים לניתוח לצורך בדיקת ביטוי של סמנים טיפוסיים של הסוג העצבי המוצגים באדום.

במבט ונאלי זה של מוח קדמי של עובר שעבר אלקטרופורציה ב-E 12 ונשלח לניתוח ב-E 14, אתר האלקטרופורציה מסומן על ידי פלואורסצנציית epi ירוקה ב-E 14. ביטוי של GFP נראה בתלמוס, בפרה-תלמוס ובהיפותלמוס, מה שמעיד על כך ששטחי ה-dying lic עברו טרנספקציה בהצלחה. התיבה המקווקו מסמנת את מיקום החתך דרך אזור ונטריקולרי אחד.

מבט מקרוב יותר על האזור הוונטריקולרי (ventricular zone) מראה את נדירתו של תאי GFP אל מחוץ לאזור הוונטריקולרי ואל תוך אזור המעטפת (mantle zone). הרשתית העוברית, שבה יתגבשו הגרעינים ההיפותלמיים, ניתנת גם היא לאלקטרופורציה בקלות, כפי שניתן לראות בחתך קורונלי זה של עוברית ביום E 16.5 שעברה אלקטרופורציה עם PCIC ביום E 15.5. כאן, הצטברותם של תאים חיוביים ל-m cherry היא ספציפית לשכבת הנוירובלסטים החיצונית, ואינה נצפית בתאי גנגליון רשתייתיים חיוביים ל-B rrn three B בשכבת תאי הגנגליון. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 30 דקות, במידה ולא עולים סיבוכים בלתי צפויים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להשתמש בטכניקות סטריליות נאותות, לשמור על יד יציבה בעת מניפולציה של העוברים, ולהכין את כל החומרים הדרושים לפני הרדמת הנקבה ההרה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן לאפשר לעוברים שעברו electrobraiding לחיות עד לבגרות, שלב שבו ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון בדיקות התנהגותיות ותפקודיות, כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות לאופן שבו מניפולציה של גנים מסוימים בעובר משפיעה על התפקוד הנוירונלי בבוגר. מאז פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום התפתחות ה-CNS לחקור תפקוד גנים in vivo בעכבר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להחדיר DNA זר לתוך צינור העצבים העוברי. באופן ספציפי, אנו מדגימים כיצד להכין נקבה הרייה לניתוח: חשיפת הרחם, הזרקת DNA וביצוע אלקטרוליזה לעובר.

אל תשכחו כי עבודה עם איזו-פלואורין עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון מערכת ספיחה (scavenging system) בעת ביצוע הליך זה.