מיפוי מעגלים עצביים מעכבים ידי Photostimulation סריקת הליזר

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את הארגון התפקודי המקומי של מעגלים עצביים מעכבים. ההליך מתחיל בהכנת פרוסות מוח חיות מקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של עכברים. השלב הבא הוא ויזואליזציה והקלטה מסוגי תאים מעכבים מטרים המבטאים GFP בפרוסות המוח.

בעקבות סריקה בלייזר זו של פוטו-סטימולציה באמצעות גלוטמט, נעשה שימוש ב-uncaging כדי להפעיל מקבצים קטנים של נוירונים פרה-סינפטיים כמעוררים או כמעכבים. זרמים פוסט-סינפטיים נמדדים בנוירונים אינטר-נוירונליים המבטאים GFP. השלב הסופי כולל ביצוע פוטו-סטימולציה, ניתוח נתונים ויצירת מפות כמותיות של קלט סינפטי לנוירונים שנמדדו.

בסופו של דבר, סטימולציה פוטו-אופטית באמצעות סריקת לייזר בשילוב עם הקלטות מתאי תא שלמים מאפשרת בנייה של מפות מפורטות של קלטים סינפטיים לסוגים ספציפיים של נוירונים מעכבים, דבר שעשוי לאפשר קביעה של הארגון והתפקוד של מעגלים עיכובים קורטיקליים מקומיים. הטכניקה המבוססת על סטימולציה פוטו-אופטית פותחה על ידי ד"ר Larry Katz ו-Ned Calloway, ופותחה בהמשך על ידי ד"ר Carols Waboda, החוקר הראשי שלי, ד"ר Xing Z שהוכשר אצל ד"ר Calloway במכון סאלק (Salk Institute), שם הוביל מחקרים רבים שבחנו מעגלים אינטרנורוניים. הקבוצה שלנו מרחיבה וממשיכה כעת מחקרים אלו, תוך חקירת מעגלים אינטרנורוניים.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, יש להקריב עכבר טרנסגני בשבוע השני או השלישי לאחר הלידה באמצעות עקירה (decapitation) ולהוציא במהירות את המוח, ולאחר מכן להניח את המוח בתמיסת חיתוך קרה ומחומצנת. לאחר מכן, השתמש במשקפי GFP כדי לסרוק חזותית את המוח ולבדוק את ביטוי ה-GFP. בשלב הבא, חתוך את קליפת המוח הסומטוסנסורית הראשית לפרוסות בעובי של 400 micrometer באמצעות ויב evidences (vibratome).

הדגרו את הפרוסות ב-A CSF המכיל סוכרוז, המובעבע עם 95%O2 ו-5%CO2 בטמפרטורה של 32 degrees Celsius למשך 30 דקות עד שעה אחת. לאחר מכן, העבירו את הפרוסות ל-A CSF רגיל בטמפרטורת החדר כדי להכין את הלייזר לניסוי, והפעילו את מערכת קירור הלייזר ואת ספק הכוח. לאחר מכן, הפעילו את כל החומרה הקשורה לבקרת הפוטו-סטימולציה, כולל מערכת מראות הסריקה, המודולטור האופטי, התריס האלקטרוני ומגבר כניסה של פוטודיודה.

כעת הפעילו את הציוד האלקטרופיזיולוגי, כגון מגבר multi clamp 700 B ומיקרו-מניפולטורים. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, פוטו-סטימולציה وديמיג' מבוצעים בתא פרפוזיה של פרוסות המורכב על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ. לאחר מכן, הפעילו את מצלמת הדימיג'; הפרוסה ת visualized במיקרוסקופ זקוף באמצעות אופטיקה של infrared DIC ואפי-פלוורסצנציה דרך מערכת הדימיג'.

לאחר מכן, פתח את תוכנת ה-FS המבוססת על MATLAB ואת תוכנת המצלמה Q capture על המסך. לפני הרצת הניסוי, בדוק את מערכת הפוטוסטימולציה בלייזר וודא שהיא במצב עבודה. הנח דף נייר מתחת לעדשת המיקרוסקופ פי 4 כדי לצפות בתבנית הסריקה של הלייזר בזמן שהמערכת פועלת.

כדי להכין מיקרו-אלקטרודה עם התנגדות של ארבעה עד שישה מגה-אוהם, משוך אלקטרודת זכוכית באמצעות שובך פיפטות (pipette puller). לאחר מכן, מלא את האלקטרודה בתמיסה פנימית המכילה 0.1% biotin לצורך סימון תאים וזיהוי מורפולוגי. לאחר מכן, הפעל את מערכת הפרפוזיה בלחץ כדי לשאוב A CSF אל תוך התא.

הבטיחו מפלס נוזלים קבוע של 2.0 millimeters מעל לפרוסה בתא. אלקווט של תמיסת המקור של MNI caged glutamate מתווסף ל-25 milliliters של A CSF במחזור, כדי להגיע לריכוז של 0.2 millimolar caged glutamate. לאחר מכן, העבירו פרוסה אחת של מוח לתא ההקלטה.

הפעילו את מערכת ההדמיה כדי לבדוק את איכות הפרוסה ולאתר אנטומית את האזור הסומטוסנסורי הראשוני. לאחר מכן, קבעו את הפרוסה באמצעות טבעת פלטינה עם חוטים שהוכנה באופן מיוחד, והיזהרו לא למקם את העוגן מעל אזור המוח המיועד להקלטה. הדמיכו את התאים באמצעות עדשה של 60x על בסיסB של ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי DIC.

זהו ובחר את סוגי התאים המעכבים. שימו לב שההקלטה תתבצע תחת בקרה ויזואלית בעזרת DIC באינפרא-אדום. ניטור וידאו ומעבר בין מצב ה-DIC למצב הפלואורסצנציה נחוצים כדי לאשר את מיקום תאי ה-GFP בזמן הורדת האלקטרודה אל תא המטרה.

באמצעות טכניקת ה-patch clamping המקובלת. ראשית, הגעיש לחץ חיובי לאלקטרודה. קרב אותה אל פני התא כדי ליצור שקע ניכר על קרומי התא המיועד.

לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי במהירות כדי ליצור giga seal ופריצה לתא (break-in), תוך ניטור תגובות הזרמת הזרם במסך הווידאו. עם השלמת הפריצה, צלם את הנוירון הפנימי המבטא GFP בהגדלה של 60x במצבי DIC ופלואורסצנציה לצורך אימות מקוון. לפני איסוף נתוני הגירוי הפוטו-אופטי, הזרק פולסי זרם היפר-פולריזציה ודפולריזציה כדי לבחון את התכונות האלקטרופיזיולוגיות הבסיסיות של כל תא.

מרגע שהושגה הקלטה יציבה של התא השלם (whole cell recording) עם התנגדות גישה טובה, שבדרך כלל היא פחותה מ-20 mega ohms, העבירו את עדשת המיקרוסקופ מהגדלה של 60 x להגדלה של four x לצורך פוטו-סטימולציה בסריקת לייזר, רכשו תמונת פרוסה בהגדלה של four x והשתמשו בה להנחיה ולרישום של אתרי הפוטו-סטימולציה. הגדירו את פרמטרי הפוטו-סטימולציה ורכישת הנתונים על ידי הפעלת מודול מתג התצורה של phys. השתמשו בפולס לייזר של one millisecond בהספק של כ-20 milliwatts עם מרווח גירוי של one second.

עבור מיפוי באמצעות גירוי פוטוני, רכשו עקומות נתונים של שנייה אחת המדגמות בתדר של 10 kilohertz. לאחר מכן, טענו את תמונת הפרוסה (four x slice) למודול המיפוי של phys. הגדירו את מיקום הסומה והגדירו את נקודות הגירוי הפוטוני בתבנית של 16 על 16, בגודל של 80 micrometer על 80 micrometer.

מרווחים סביב מיקום התא, המכסה את כל השכבות הקורטיקליות. לאחר מכן, מיפו את פרופיל העירור של הנוירון המוקלט על ידי בחינת מיקומי הפריקה (spiking) בתגובה לגירוי פוטו-סטימולציה במצב clamp של זרם. התוכנה הנוחה למשתמש שלנו, הכוללת תכונות תצוגה מקוונת, מקלה על ניסויי המיפוי.

לאחר מכן, מפו את קשרי המעגל המעורר המקומי על ידי זיהוי זרמי הפוסט-סינפטיים מעוררים מהתא המוקלט. בעזרת סריקה בלייזר במיקומים שונים, החזיקו את התא במתח של 70- millivolts במצב voltage clamp כדי לזהות זרמי עירור פנימה. לאחר מכן, חזרו על מיפוי זרמי הפוסט-סינפטיים מעוררים פעמיים עד שלוש, כאשר תבנית הגירוי הפוטוני מסובבת או הפוכה. כדי למפות את קשרי המעגל המעכב המקומי, זהו את זרמי הפוסט-סינפטיים מעכבים מהתא המוקלט.

שמר את התא במתח קרוב לאפס מיליוולט במקרה זה, 15- מיליוולט במצב voltage clamp, כדי לזהות זרמים מעכבים יוצאים. לאחר השלמת כל הבדיקות הפיזיולוגיות, הוצא בעדינות את האלקטרודה מהתא שנמדד. הוצא את פרוסת המוח מהתא, קבע אותה ב-4%para formaldehyde למשך לילה, וצבע את התאים שנמדדו נגד biotin.

בניסוי זה, השילוב של ביטוי GFP, אלקטרופיזיולוגיה אינטרינזית ומאפיינים מורפולוגיים משמש לסיווג של הנוירונים המעכבים. מוצג כאן דוגמה ומפה של נתונים גולמיים להדגמת סטימולציה פוטו-לסרית סורקת, המאפשרת מיפוי נרחב של קשרי מעגלים קורטיקליים מקומיים לנוירון המעכב שנרשם. להלן דוגמאות למפות קלט כמותיות מקודדות צבע, שנגזרו מהעקבות הגולמיות שהוצגו זה עתה באיור D. האמפליטודות של האירועים הסינפטיים שזוהו בנוירון הבינוני שנרשם מקודדות בצבע ומונחות בצורה טופוגרפית מעל מיקומי הפוטו-סטימולציה.

מיקום גוף התא מסומן בעיגול אדום פתוח בסרגל הקנה. הצבעים החמים מעידים על קלטים סינפטיים חזקים וצבעים קרים מעידים על קישוריות חלשה או היעדר קישוריות לתא המטרה. באופן דומה, איור E מציג את מספר האירועים הסינפטיים לכל מיקום דגימה של שחרור פוטו-כימי (uncaging) לנוירון המוקלט.

איור F מדגים את זמן ההתחלה של האירוע הסינפטי הראשון שזוהה בתא המוקלט לאחר גירוי פוטו-סטימולציה, כפי שמופיע בסרגל הקנה. הצבעים החמים מעידים על קלט קצר, השהיה (latency), וצבעים קרים מעידים על השהיות סינפטיות ארוכות יותר. לפיכך, LSPS מאפשר בנייה של מפות מפורטות של המיקום, העוצמה, ההשהיה ומספר הקלטים הפועלים על סוגים ספציפיים של נוירונים מעכבים.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לגלות סבלנות, להבטיח תנאי ניסוי נקיים, ולהעביר את הנוירונים ביעילות ובזהירות רבה מהגדלה גבוהה להגדלה נמוכה. לבסוף, יש להשתמש בתוכנה בצורה מיטבית.