Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell
14 ביוני 2011
טכניקה צדדי ליתוגרפיה פלזמה פותחה כדי ליצור דפוסים משטח יציב להדרכת מצורף הסלולר. טכניקה זו יכולה להיות מיושם כדי ליצור רשתות התא כולל אלה המחקות רקמות טבעיות שימש לחקר מספר סוגי תאים שונים.
המטרה הכללית של הניסוי הבא היא ליצור מיקרו-סביבות תאיים כדי לבחון שאלות ביולוגיות הנוגעות להתנהגויות של תאים בודדים ושל קבוצות תאים המתרחשות במימדי מיקרו וננו. דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון תבניות שיכוונו בסופו של דבר את מיקום התאים. לאחר מכן, עיצובים אלו מתורגמים למשטחים בעלי תבנית באמצעות פוטוליתוגרפיה, המאפשרת יצירת תבניות מיגון פלסמה באמצעות ליתוגרפיה רכה.
לבסוף, תבניות מיסוך אלו מסודרות כחצובה בתוך צלחת פטרי כדי לאפשר חשיפה סלקטיבית של המשטחים שמתחתן לפלסמה, אשר תשאיר דפוס כימי הרגיש לתאים באזורים שמתחת לכל תבנית. ניתן לקבל תוצאות המראות כיצד התנהגות התא תלויה במיקרו-סביבתו ובאינטראקציה שלו עם תאים שכנים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח לגבי השפעותיהן של מיקרו-סביבות על התנהגות תאים, כגון כיצד אינטראקציות בין קבוצות של תאים משפיעות על תופעות מסדר גבוה יותר?
וכיצד רמזים ננו-מטריים תת-תאיים משפיעים על תפקודים כגון נדידה ובריאות והתמיינות? ראשית, השתמשו בדבק מהיר כדי להצמיד שקופית עם תבנית למחסנית של שקופיות ריקות. לאחר מכן, צרו מכל מנייר אלומיניום הגדול מעט ממחסנית השקופיות, ומספיק גדול כדי להכיל 30 grams של poly dimethyl suboxane או PDMS.
הניחו את ערימת השקופיות בתוך המיכל ולאחר מכן שפכו PDMS מעל ערימת השקופיות כדי ליצור תבנית ראשונית. לאחר מכן, בצעו דגזינג (Degas) ל-PDMS על ידי הנחת המיכל בתוך תא ואקום. שברו בועות אוויר שנותרו ב-PDMS על ידי הסרה והחזרה מהירה של אצבע מעל צינור שסתום היניקה מספר פעמים, כדי לאפשר באופן רגעי זרימה של אוויר אל תוך התא.
השסתום נשאר סגור למשך חמש דקות של ניתוק גזים רציף. לאחר מכן, יש להניח ל-PDMS להתבשש במנדף הזרימה הנקי בטמפרטורת החדר למשך יום עד יומיים. לאחר ההבשלה, מקלפים את ה-PDMS מהדפוס המאסטר, ובכך יוצרים תבנית.
בשלב הבא, שפכו שכבה דקה של 6 g של אפוקסי דו-מרכיבי שערבובו נמשך דקה אחת בלבד אל תוך תבנית המאסטר. בצעו ניקוי בועות (Degas) לאפוקסי באופן מיידי באמצעות מחזורי שבירת בועות מרובים לפני שהאפוקסי יתגבש. לאחר שהאפוקסי שעבר Degas הושאר ללא הפרעה למשך שעה, הוא יהיה במצב של פולימריזציה חלקית.
הוסף אפוקסי נוסף לתבנית ללא ניקוי בועות (degassing) כדי ליצור מבנה עבה יותר, שיהיה קל יותר לטיפול בשלבים מאוחרים יותר. לאחר מכן, הנח לאפוקסי להתביש במשך יום עד יומיים. לאחר שהתבנית מאפוקסי התביישה, הוצא את האפוקסי מתבנית המאסטר של ה-PDMS, ולאחר מכן עטוף סרט הדבקה סביב תבנית האפוקסי כדי ליצור מיכל.
ניתן ליצור תבנית עבודה על ידי שפיכת PDMS על תבנית האפוקסי, ביצוע ואקום (degassing) ל-PDMS ואשור התבנית החדשה למשך יום עד יומיים. לאחר שהתבנית העובדת מאשורה, קלפו אותה מהאפוקסי ואחסנו את שתיהן בתוך צלח Petri בתוך מיכל פלסטיק אטום בתוך תא זרימה כדי לשמור על הנקיון. כדי להכין תבנית לתבנית פני שטח, חתכו חלקים קטנים מהתבנית העובדת בעזרת להב תער וחלקו את החלקים לתוך צלח Petri.
מיקומי חלקי התבנית הללו מסומנים בגב צלחת הפטרי באמצעות מרקר קבוע, על ידי שרטוט קווי מתאר סביב המיקומים שבהם מונחים חלקי התבנית. צרו חצובה מחלקים אלו והניחו משקולת על החצובה כדי להבטיח מגע הדוק (conformal contact) בין התבנית העובדת לבין פני השטח של צלחת הפטרי. הסתכלו על תחתית הצלחת כדי לוודא מיקום נכון, כפי שניתן לראות בנוכחות של תעלים הגלויים לעין בלתי מזוינת או באמצעות זכוכית מגדלת קטנה. הכניסו את המבנה לתא פלזמה.
התחל את טיפול הפלסמה לאחר טיפול הפלסמה. הסר את התבנית ואת סידור המשקולות והנח את צלחת הפטרי בתוך תא בטיחות ביולוגית תחת אור UV למשך 10 דקות לצורך עיקר. אחסן את הצלחת שם עד לזריעת התאים בה.
דללו את תאי הניסוי הנבחרים במצע הגידול הסטנדרטי שלהם כדי להגיע לרמת ההצטברות (confluence) הרצויה. לאחר הנחתה על פני השטח של פטריית הפטרי עם התבנית, מזגו שלוש מיליליטר של תמיסת התאים אל תוך פטרית הפטרי. דגרו את פטרית הפטרי עם התבנית בטמפרטורה של 37 °C, 5% carbon dioxide ו-100% לחות למשך מספר שעות עד מספר ימים, כדי לאפשר לתאים להתרכז על התבנית שנוצרה על ידי תא הפלזמה.
התבנית נבדקת באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה (phase contrast). בעת תרבית של תאי נוירובלסטומה, יש להוסיף 10 micromolar של רטינואיק אסיד מדי יום, עד לצפייה בדפרנציאציה של התאים למצב דמוי נוירון. יש להחליף את מצע התרבית הסטנדרטי בכל שלושה עד ארבעה ימים.
תוצאה טיפוסית של יישום טכניקת הליתוגרפיה בפלסמה היא יצירת תבנית של תאים הדומה למבנה שרירותי או טבעי כלשהו. דוגמה לכך ניתן לראות כאן בדמות זו, עם נוירונים שעברו דיפרנציאציה באמצעות רטינואיק אסייד על תבנית של קווים. וכאן בדמות זו, שבה נוצרו קווים ורשתות של נוירונים, ניתן להשתמש גם בסוגי תאים שאינם נוירונים, כפי שניתן לראות בשתי הדמויות הבאות: דמות זו מציגה תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי, ודמות זו מציגה תאי שריר שלד C2C12 היוצרים רשתות, כפי שניתן לראות כאן.
ניתן להגדיר תבניות גם עבור חומרים כגון polylysine כדי להקל על היצמדות של סוגי תאים מסוימים ולשימושים אחרים. לאחר הליך זה, ניתן לשלב קלטים נוספים, כגון מיקרופלואידיקה, בדיקת תאים או מניפולציה גנטית של חלבונים ספציפיים, במטרה לענות על שאלות נוספות, כגון כיצד שילובים של גירויים משפיעים על התנהגות תאים בודדים ועל התנהגות תאית מסדר גבוה יותר?
סקירה כללית
פותחה טכניקה רב-גונית של ליתוגרפיית פלזמה ליצירת תבניות שטח יציבות המכוונות היצמדות תאית. שיטה זו מאפשרת יצירה של רשתות תאים המדמות רקמות טבעיות ומסייעת בחקר סוגי תאים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- ביו-חומרים
רקע
- הבנת התנהגות תאים במימדי מיקרו וננו היא קריטית למחקר ביולוגי.
- מיקרו-סביבות תאיות משפיעות באופן משמעותי על התנהגות תאים בודדים וקבוצות תאים.
- ליתוגרפיית פלזמה מספקת שיטה ליצירת סביבות מבוקרות לחקר התנהגויות אלו.
- בטכניקות קודמות חסרה גמישות ביצירת תבניות עבור סוגי תאים שונים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ליצירת מיקרו-סביבות תאיות המכוונות את מיקום התאים.
- בחינת האופן שבו מיקרו-סביבות משפיעות על התנהגות תאים ועל אינטראקציות ביניהם.
- חקירת ההשפעות של רמזים בקנה מידה ננומטרי על תפקודי תא כגון נדידה ודיפרנציאציה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- תכנון תבניות להצבת תאים.
- שימוש בפוטוליתוגרפיה ליצירת תבניות למיגון פלזמה.
- החלת טיפול בפלזמה ליצירת דפוסים כימיים על פני השטחים.
- זריעת תאים על פני השטחים המדופסים ותצפית על התנהגותם.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של תבניות תאים הדומות למבנים טבעיים.
- הדגמה שלוביה של תאי נוירובלסטומה למצבים דמויי נוירונים.
- תצפית על אינטראקציות בין סוגי תאים שונים על פני שטח בעלי תבניות.
- הדגשת תפקידם של מיקרו-סביבות בהשפעה על התנהגות התאים.
מסקנות
- טכניקת הליתוגרפיית פלזמה יעילה לחקר התנהגות תאים בסביבות מבוקרות.
- ניתן להתאים שיטה זו לסוגי תאים ולשאלות מחקר שונות.
- מחקרים עתידיים יכולים לשלב טכניקות נוספות כדי לחקור לעומק אינטראקציות בין תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תבנית פני שטח באמצעות ליתוגרפיית פלסמה מאפשרת הנדסה מדויקת של מיקרו-סביבות תאיים, התומכת במחקרים ברזולוציה גבוהה של התנהגות תאים ואינטראקציות ביניהם. יכולת זו היא קריטית לצמצום סיכונים בהנחות מחקר ראשוניות ולקידום מודלים חיזוי של היווצרות רקמות ואיתות תאי. היציבות של השיטה ותאימותה לסוגי תאים מגוונים ממצבים אותה כפלטפורמה רב-פעמית למחקר תרגומי ולפיתוח מודלים פרה-קליניים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של תגובות תאיות לרמזים מיקרו-סביבתיים מוגדרים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד משתנים כגון נדידה, היצמדות ודיפרנציאציה.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות יצירה מבוקרת של רשתות תאים.
- משפר את רמת הביטחון החזויית בגילויים מבוססי מסלולים ופנוטיפים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק מצעים תבניתיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות כמותיות מבוססות תאים.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של משטחים מוכנים לבדיקה עבור סריקת תרכובות.
- תומך בהערכה חסונה של התנהגות תאים תחת אילוצים מרחביים מוגדרים.
- מאפשר שימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים ותנאי ניסוי מרובים.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מיישר רשתות תאים in vitro עם ארכיטקטורות רקמה רלוונטיות למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מאפשר מחקרים ארוכי טווח של התמיינות, הסתגלות ואיתות בין-תאי.
- תומך בקידום מודלים פרה-קליניים בהתאמה לסיכון, על ידי אישור מניפולציה נפרדת של סביבות תאיות.
- משפר את גילוי הביומארקרים באמצעות תצפית מבוקרת על אינטראקציות בין תאים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת ליתוגרפיית הפלסמה הזו משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר פרה-קליני, ובכך מאפשרת בדיקה רציפה של היפותזות ותיקוף של מודלים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על התנהגות תאים ויצירת רשתות תחת תבניות כימיות מוגדרות.
- סריקה: מספק תוצאים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך השוואה של תגובות תאיות למשתנים ניסיוניים.
- אנליטיקה: מספק קריאות בעלות תוכן גבוה עבור מדדי נדידה, היצמדות ודיפרנציאציה.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים in vitro למודלים פרה-קליניים על ידי חיקוי מבני רקמה טבעיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה יציבה וביוקומפטיבילית הניתנת להתאמה למספר תוכניות מו"פ ולסוגי תאים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: מספק מצעים בעלי תבניות סטנדרטיים, ניתנים להרחבה וניתנים לשחזור עבור תהליכי עבודה מגוונים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) והתקדמות יעילה של תיק הפיתוח מבחינת הון.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסי גילוי ונכסים פרה-קליניים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של פני השטח, פוטוליתוגרפיה וטכניקות לתרבית תאים.
- דורש גישה לתאי פלזמה, מנדפי זרימה נקיים ותשתיות מיקרוסקופיה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות (reproducibility) בין ניסויים ואתרים שונים.
- ניתן להתאמה למגוון מצעים פולימריים ותואם לסוגי תאים מרובים.
- יציבות התבנית תומכת במחקרים ארוכי טווח, אך עשויה לדרוש אופטימיזציה עבור יישומים ספציפיים.
