התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית
22 בספטמבר 2011
שיטה myography אוטומטית עבור מדידות כוח בעורקים mesenteric מבודד מתואר. היא מעסיקה Mulvany-Wire הלפרן כפול אוטומטי Myograph 510A לקבוע התגובות phenylephrine וסידן תאיים. השיטה מאפשרת קביעת עקבית של תגובות איזומטרי כדי אגוניסטים בכלי קטן של קטרים של 6-30 מיקרומטר, באופן עצמאי.
נוהל זה משתמש בחולדות מסוג doll הרגישות למלח והעמידות למלח כדי להשוות את התגובתיות של עורקי התנגדות מזנטריים לסידן חוץ-תאי תחת מתח של פנילפרין. הדבר מבוצע תחילה על ידי בידוד הקשת המזנטרית מהחיות ודיסקציה של ענפי עורקי ההתנגדות. לאחר מכן, חוטי פלדה אל-חלודה ראשון מתוך שניים מושחל דרך מקטע קצר של העורק המבודד, והכלי מורכב בתוך תא הגרף.
לאחר מכן, משחילים את תיל הפלדה השני דרך לומן כלי הדם במקביל לתיל הראשון. בשלב הבא, מותחים את כלי הדם המותקן עד להשגת היקף פנימי מנורמל. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא להפעיל מחדש את כלי הדם על ידי גירוי באמצעות יישומים חוזרים של phenylephrine והרפייתו באמצעות יישומים מצטברים של calcium.
בסופו של דבר, התוצאות מראות שינויים במתיחות של כלי הדם, אותם ניתן להמיר לעקומת תגובת סידן ולהשתמש בהם כדי לקבוע ערכי EC 50. לצורך השוואה, הרעיון להשתמש בשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר גילינו שהרשת העצבית של ה-Masonary batteries בחולדה ביטאה קולטן סידן רגיש ל-gpro copper.
ניתן לחקור זאת באותה דרך שבה נחקרים קולטני AIC למרירות, המופעלים על ידי אגוניסט. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות מכיוון ששכבות האנדותל והשריר החלק דקות. כלי דם נפגעים בקלות.
אם הדבר קורה, התכונות המכניות של כלי דם אלו עלולות להיפגע. לתחילת העבודה, הכינו את אזור העבודה ואת המכשירים הכירורגיים. הניחו בעל חיים הרדום על גבו ונגבו את הבטן באלכוהול.
לאחר ביצוע לפרוטומיה בקו האמצע, השתמש במספריים כדי להסיר כ-85 סנטימטרים של מעי, כולל את העורק המזנטרי העליון. חתוך את הקצה הפרוקסימלי קרוב לפילורוס ואת הקצה הדיסטלי סמוך לחיבור האיליאו-צקאלי. העבר את החלק שהוסר לתוך צלחת פטרי מצופה המכילה תמיסות מלח פיזיולוגית או PSS בטמפרטורת החדר.
הקבע באמצעות סיכות את הקצה הפרוקסימלי של המעי לימין, ולאחר מכן הקבע את שאר המעי בכיוון נגדי לשעון. כעת, בצע דיסקציה למקטע של העורק המסרק (mesenteric artery) המכיל את ענפים שני ושלושה, יחד עם חלק מהמעי מהקצה הפרוקסימלי. זהה את נקודת הפיצול בצורת V של העורק המסרק ובצע דיסקציה כדי להפרידו מהוריד.
השתמשו בפינצטה כדי להסיר בעדינות רקמת שומן ורקמת חיבור כדי למנוע מגע ישיר עם העורק. כדי להתחיל את קיבוע כלי הדם, חתכו שני מקטעי עורק באורך של כ-2 mm. ניתן להשתמש בקצה של תיל פלדה שאינו מכיל טונגסטן באורך 4 cm ובקוטר 40 µm כדי לפתוח את לומן העורק.
לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להחדיר את התיל לתוך הלומן של כל עורק. תוך הקפדה שלא לפגוע באנדותל, מלאו את תא השתל השרירי ב-PSS בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. השתמשו בפינצטה כדי להעביר את מקטע הכלי המחוט אל התא.
בשלב הבא, העבירו את מקטע כלי הדם הפרוקסימלי שנכרת אל תא המיוגרף ומשכו את הקצה לאורך התיל כדי להחדירו לתוך כלי הדם. הימנעו ממתיחת כלי הדם. הדקו את הקצה הקרוב של התיל נגד כיוון השעון תחת בורג הקיבוע הקרוב בלסת הימנית המחוברת למיקרומטר.
תפסו את הקצה החופשי של התיל בעזרת פינצטה והדקו אותו בכיוון השעון תחת בורג הקיבוע הרחוק בלסת הימנית, תוך וידוא שקטע כלי הדם לאורך התיל ממוקם במרווח שבין הלסתות ללא כל מגע עם הלסת עצמה. הבריגו את הלסתות לצדדים. יישרו את התיל השני במקביל לכלי הדם והחדירו אותו אל הקצה הרחוק של הלומן.
השחילו בעדינות את התיל דרך הלומן של מקטע כלי הדם בתנועה אחת, תוך שימוש בתיל שכבר הותקן כמדריך. החזיקו את התיל במרחק של כסנטימטר מכלי הדם כדי למנוע את מתיחתו במהלך התמרון ולהימנע ממגע עם האנדותל. הבריגו את הלסתים יחד וודאו שהתיל השני להרכבה נע מתחת לראשון המאובטח בצד ימין.
קבעו את הקצה הקרוב של חוט השני בכיוון השעון תחת בורג הקיבוע הקרוב של הלסת השמאלית המחוברת למתמר. קבעו את הקצה הרחוק של החוט תחת בורג הקיבוע שבלסת השמאלית והדקו אותו כדי למתוח את החוט. עם השלמת ההרכבה, המתינו 30 דקות להשגת שיווי משקל בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר ההשגה של שיווי משקל, המנוע מאתחל מתוך תפריט ההרכבה, ותהליך הנורמליזציה, המותח את הכלי להיקף פנימי נורמלי, מתחיל. כדי להתחיל, פתח את תפריט הנורמליזציה והגדר את הלחץ הטרנסמוראלי (transmural pressure) למטרה של 13.3 kilopascals. לאחר מכן, הגדר את משך הזמן של כל אחד משלבי הנורמליזציה ל-60 seconds.
היחס בין IC one ל-IC 100 צריך להיות 0.9 ויש להגדיר את כיול ה-IP כ-two star delta. מדוד את אורכה של העורק המסריכאי המותקן באמצעות קריאות עינית המיקרוסקופ כאשר קווי השערה נמצאים מעל הקצוות הרחוק והקרוב של מקטע כלי הדם. לאחר נורמליזציה, כלי הדם מופעלים מחדש על ידי ביצוע start סטנדרטי המורכב מסדרת גירויים ותקופות שטיפה (washout).
ראשית, החליפו את כיסוי תא המיו (myo chamber) והתחילו באוורור עם 95% air ו-5% carbon dioxide. מלאו את התא ב-PSS טרי המכיל 100 micromolar ascorbic acid. גרמו לכיווץ של כלי הדם באמצעות five micromolar fennel, rine, או PE למשך חמש דקות, ושטפו ארבע פעמים עם בופר PSS. לאחר השטיפה האחרונה, מלאו שוב את התא ב-PSS והמתינו שלוש דקות לפני מילוי התא שוב ב-PSS וביצוע כיווץ באמצעות PE. כפי שהודגם בעבר, העורק מוכן כעת לניסוי.
מדדו את הרפיית כלי הדם המכווצים על ידי הוספה מצטברת של ריכוזים עולים של סידן כלורי. טבלה זו מראה כי המתחים הבסיסיים לאחר יישום פנילֶפרין השתנו בין חולדות wistar DS (רגישות למלח של doll) לבין חולדות DR (עמידות למלח של doll). עקבה זו מחולדת wistar מראה רפיה של עורקים שכווצו על ידי PE באמצעות הוספות מצטברות של סידן; הרפיה זו הייתה פגועה קשות ברקמות מחולדות DS בהשוואה לחולדות Wistar ובהשוואה לחולדות DR. כפי שניתן לראות כאן, ניתן להבחין בהבדלים ברגישות לסידן בעקומות התגובה לסידן ושוב בעת חישוב ערכי ה-EC 50.
לבסוף, חולדות DS מראות הפחתה בביטוי של קולטן תחושת הסידן בעורקים בהשוואה לחולדות Dr.Rats. לאחר שליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן השוואת התגובתיות הווסקולרית של עורקים אנטריים קטנים לתרכובת חיצונית בתנאים איזומטריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה אוטומטית למיוגרפיה למדידת כוח בעורקים מזנטריים מבודדים. הטכניקה משתמשת ב-Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A להערכת תגובות לפנילפרין וסידן חוץ-תאי, מה שמאפשר מדידות עקביות של תגובה איזומטרית בכלי דם קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של כלי דם
- טכניקות של מיוגרפיה
רקע
- לעורקים המזנטריים תפקיד מכריע בוויסות זרימת הדם.
- הבנת התגובתיות שלהם חשובה למחקר קרדיווסקולרי.
- פנילפרין (Phenylephrine) הוא אגוניסט נפוץ המשמש לחקר תגובות כלי דם.
- רמות הסידן הן קריטיות להתכווצות השריר החלק בכלי הדם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה למדידת כוח בעורקים מזנטריים קטנים.
- השוואת התגובתיות של חולדות רגישות למלח וחולדות עמידות למלח.
- הערכת ההשפעות של פנילפרין וסידן על תגובות כלי דם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של קשת מזנטרית (mesenteric arcade) מחולדות.
- דיסקציה של ענפי עורקי התנגדות.
- קיבוע עורקים בתא מיוגרף באמצעות חוטי פלדת אל-חלד.
- החלת פנילפרין וסידן להערכת תגובתיות כלי דם.
תוצאות עיקריות
- הושגו מדידות כוח עקביות בעורקים מבודדים.
- נצפו הבדלים בתגובתיות בין חולדות רגישות למלח לחולדות עמידות למלח.
- פנילפרין השרה ביעילות מתח בעורקים.
- הוספת סידן הובילה להרפיה של כלי הדם.
מסקנות
- שיטת המיוגרפיה האוטומטית מספקת גישה מהימנה לחקר תגובות כלי דם.
- טכניקה זו יכולה לשפר את ההבנה של תפקוד העורקים המזנטריים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על מחקר של מחלות קרדיו-וסקולריות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיוגרפיה אוטומטית של חוטים בעורקים מזנטריים מאפשרת הערכה כמותית ומדויקת של תגובתיות כלי דם בתנאים איזומטריים, ובכך תומכת בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של מחקר קרדיו-וסקולרי. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי להפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות כלי דם ומסייעת בקבלת החלטות לגבי פורטפוליו של תוכניות למלחמה ביתר לחץ דם ובתפקוד לקוי של כלי דם. השחזוריות של השיטה והתוצרים הכמותיים שלה מקלים על השוואה הדדית איתנה של השפעות תרכובות ומודלים גנטיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד קולטני שריר חלק כלי דם ומסלולי אותת.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי כימות תגובות התכווצות והרפיה לאגוניסטים ולאנטגוניסטים.
- מסייע בביטחון חיזוי בבחירת מטרה עבור אינדיקציות כלי דם ומחלות לב וכלי דם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות כלי דם ex vivo מתוקפות לסריקת תרכובות ומחקרי מנגנון.
- מספק מדידות מתח סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וכמותיות לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מאפשר השוואה מקבילה של חומרים פרמקולוגיים ומודלים גנטיים בפורמט הניתן להרחבה (scalable).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני תגובתיות כלי דם ex vivo למודלים רלוונטיים למחלה של יתר לחץ דם ודיספונקציה וסקולרית.
- תומך בזיהוי ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור ביטוי רצפטורים לתוצאות תפקודיות.
- מספק רצף מהשלבים המוקדמים של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות כלי דם.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה אוטומטית זו למיוגרפיה משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי בביולוגיה של כלי הדם.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה את יכולת הכיווץ וההרפיה של כלי דם כדי לבחון היפותזות לגבי תפקוד וסיגנלינג של רספטורים.
- סריקה (Screening): מספקת תכשירי כלי דם הניתנים לבדיקה וניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות ודירוג עוצמתן.
- אנליטיקה: מייצרת ערכי EC50 ועקומות תגובה להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים ומודלים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין נתונים פונקציונליים ex vivo למודלים של מחלות in vivo ולאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה סטנדרטית לחקירה מתמשכת של מטרות ומסלולים וסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות כלי דם.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות תגובתיות של כלי דם סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפורטפוליו של מחלות לב וכלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות כלי דם ותרכובות בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של כלי דם וטיפול ברקמות ex vivo.
- נדרשת גישה למכשור מיוגרפיה של תלי כבלים (wire myography) אוטומטי ולתוכנה אנליטית.
- נדרש סטנדרזציה קפדנית בין צוותי העבודה בנוגע לנהלי קיבוע כלי הדם והנורמליזציה.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור סוגי כלי דם שונים או מודלים של מחלות.
- גודלם הקטן של כלי הדם מגביר את הסיכון לנזק מכני, דבר המשפיע על מהימנות הבדיקה.
