Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי
13 בנובמבר 2011
פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.
המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף RNA כולל מגרעיני מוח נפרדים באופן הניתן לשחזור, עקבי, חסכוני ובסביבה נקייה מ-RNA. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת סביבת עבודה נקייה מ-RN והוצאת המוח השלם מעכבר שעבר דקפיטציה. לאחר מכן, נעשה שימוש בקוצץ רקמות המופעל באמצעות מיקרומטר כדי לחתוך חתכי רקמה סדרתיים בגודל אחיד.
לאחר מכן, אזורי מוח רלוונטיים מבודדים במיקרו-דיסקציה באמצעות גליל רקמה בעל קוטר קבוע, תוך שמירה על הרקמה בסביבת מדיום נטולת RNA. לבסוף, RNA כולל מבודד מהגרעיני המוח שהוצאו. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות תנובת ואיכות מספקת של RNA כולל עבור הכנת ספריית cDNA המשך ובדיקת פרופיל של הטרנסקריפטום באמצעות בדיקות ספקטרופוטומטריות או פלואורומטריות.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כריתה גסה של אזורי מוח באופן אנטומי או כריתה בסיוע מיקרוסקופיית לכידה בלייזר, הוא שניתן לאסוף מספר אזורי מוח נפרדים בעלי עניין ממוח של עכבר בודד באופן הניתן לשחזור ובעלות סבירה. שיטה זו עשויה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האם פרופילים מובחנים של ביטוי תסריפטים בתוך אזורי מוח שאינם קשורים למעגלים עצביים עשויים להיות במתאם עם תכונות התנהגותיות מסוימות, תגובות סביבתיות ו/או מצב מחלה. כדי להכין את התמיסות למיקרודיסקציה, הוסיפו ל-100 milliliters של Earl's balanced salt solution או EBSS כמות של 0.44 grams של sodium bicarbonate ו-0.884 grams של glucose.
טפל את ה-EBSS עם 0.1 milliliters של DEPC בבקבוק או בכלי זכוכית הניתנים לסטריליזציה באוטוקלאב עם מכסה הברגה למשך 12 שעות לפחות, בטמפרטורה של 37 °C. הנח פיפטות זכוכית באורך five and three quarter inches לתוך כלי זכוכית (beaker) בנפח של 1 liter, והנח מברשות צבע כאשר הסיבים פונים כלפי מעלה לתוך משורבב זכוכית בנפח של 100 milliliters.
הוסיפו תמיסת מים שעובדו ב-DEPC בכמות מספקת כדי לכסות את הפיפטות והמברשות. כסו את הביקר ואת המשורה בנייר אלומיניום והדגירו לפחות 12 שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה של 12 שעות עם DEPC, חממו את כל החומרים שעובדו ב-DEPC לטמפרטורה הגבוהה מ-100 °C למשך לפחות 15 דקות. צננו את ה-EBSS לטמפרטורת החדר לפני האחסון ב-4 °C.
שפכו את ה-DD H2O מהכלי (beaker) ומהמשפך המדורג והמשיכו לדגור אותם בטמפרטורה הגבוהה מ-100 °C עד שהחומרים יתייבשו. הוציאו אותם מהמדגר, קררו אותם לטמפרטורת החדר ואחסנו לשימוש מאוחר יותר. ביום הניסוי, טפלו בכל משטחי העבודה כדי להסיר זיהומי RNA והניחו את ה-EBSS במקלח מים המכוון ל-40 °C לצורך בופור ואספקת חמצן.
הגשרו את ה-EBSS ב-5% CO2 ו-95% חמצן על ידי הנחת צינור גז בתוך פיפטה של פסטור נקייה מ-RNA. לאחר הכנסת הפיפטה לתוך ה-EBSS, כסו את פתח המכל של ה-EBSS. הכינו סורח רקמות (tissue slicer) לחיתוך סדרתי של רקמת המוח.
טפלו במשטחים העליון והתחתון של חותך הרקמות. כדי להסיר זיהומי RNA, הצמידו פיסה מלבנית של נייר סינון Watman מספר 4 למשטח הפלקסיגלאס של קוצץ הרקמות. הצמידו להב תער דו-צדדי לזרוע הקוצץ.
כוון את המיקרומטר לאפס וכוון את הגובה המינימלי של זרוע הקוצץ (chopper) כך שלהב התער יחתוך את נייר המסנן, אך לא את לוח הפלקסיגלאס. אסוף את כל החומרים הנוספים הדרושים למיקרו-דיסקציה, כולל צלחות תרבית תאים במידה של 60 על 15 מילימטר נטולות RNA, טיפים למקרו-פיפטה בנפח של 200 µL נטולי RNA, מספריים מעוקלים, קרח יבש ומבחנות לאיסוף רקמות. הנח את המבחנות על קרח יבש לאחר ביצוע דקפיטציה לעכבר באמצעות גילוטית למכרסמים והוצאה של המוח השלם, כאשר גם המוח האחורי וגם העצבים האופטיים נשארים שלמים.
הנח את המוח בחלק העליון של צלחת תרבית תאים נטולת RNase בגודל 60 על 15 מילימטרים. לאחר מכן, העבר אותו למשטח העבודה לדגימת רקמות. השתמש בפיפטה נטולת RNase כדי להרטיב בעדינות את נייר המסנן המחובר לקוצץ הרקמה באמצעות EBSS.
הרטיבו את רקמת המוח באמצעות EBSS. העבירו את המוח לקוצץ הרקמות (tissue chopper) ומקמו אותו כך שהשטח הוונטרלי (ventral surface) ינוח על נייר המסנן. קו האמצע יהיה מאונך ללהב הקוצץ, והקצה הרוסטרלי (rostral edge) של המוח יהיה צמוד ללהב.
השתמש במברשת ציירים שעברה טיפול ב-A-D-E-P-C כדי להחזיק את המוח ללא תזוזה על ידי הפעלת לחץ עדין על פני השטח הדורסליים של המוח. הרם את מנוף מחזיק הלהב כארבעה עד חמישה סנטימטרים מעל פני השטח של הרקמה הדורסלית והחזק אותו במצב זה. הסר את המברשת מפני השטח של המוח וכוון ל-750 micrometers.
שימוש במיקרומטר. יש להניח למנוף לרדת כדי לחתוך את הרקמה וליצור נתח קורונלי בעובי 750 micrometer, בעוד להב החיתוך נותר נייח. השתמשו בתנועת גלגול עם מברשת ציירים כדי להזיז בעדינות את נתח הרקמה הרחק מפני השטח של הלהב.
העבירו מיד את נתח הרקמה אל ה-EBSS המחומצן שבצלחת הפטרי. פרוסה זו מוכנה כעת למיקרו-דיסקציה. חזרו על הליך החיתוך עד לקבלת חיתוכים סדרתיים של המוח לאורך כל המישור הרוסטרו-קודאלי (rostro-caudal) לצורך ביצוע המיקרו-דיסקציה.
ראשית, בדקו את התאורה כדי להבטיח שהארת הדגימה לא תיחסם. כווננו את המיקום ואת הזרימה של תערובת ה-O2 CO2 כדי לשמור על סביבה מחומצננת ומבופרת עבור הרקמה. במהלך ההליך, זהו את חיתוך המוח הקורונלי הכולל את אזור העניין, ובעזרת מכחול, יישרו אותו באופן שטוח על תחתית פטרי dish.
בחרו את המחלץ (tissue core) בעובי הקוטר המתאים. החזיקו את נתח הרקמה במישור המסתיר (coronal section) במקומו באמצעות מברשת ציירים והורידו את קצה החיתוך של המחלץ אל פני השטח של נתח הרקמה. תוך כדי הפעלת לחץ, דחפו את קצה המחלץ דרך נתח הרקמה עד לדחיסה חזקה לתחתית פטרי הדייש.
השתמשו בתנועה סיבובית גולגלת כדי להבטיח שהאזור המבוקש התנתק מהרקמה שמסביב. הרימו בזהירות את גליל הרקמה מהחתך הרקמתי ושחררו את המיקרו-פאנץ' כך שירחף ב-EBSS באמצעות מברשת צבעים. העבירו מיד את המיקרו-פאנץ' של הרקמה לשפופרת אחסון יציבה בטמפרטורה של 80- °C הנשמרת על קרח יבש.
הרקמה צריכה להיצמד בקלות לדופן הפרונט. החזירו את הפרונט המכיל את דגימת המיקרודיסקציה לקרח היבש. חזרו על תהליך מיקרודיסקציה זה עבור כל אזור מוחי רלוונטי.
עם השלמת המיקרו-דיסקציה, רשמו את התווית או את הברקודיים המתאימים לכל מבחנה המכילה דגימה. העבירו את דגימות הרקמה למקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד לשלב מיצוי ה-RNA, לצורך מיצוי RNA מדגימות הרקמה. ראשית, הכינו סביבת עבודה נקייה מ-RNA.
הכינו כמות מספקת של תערובת חרוזיים מגנטיים ושל תמיסת ליזיס וקישור (lysis binding solution) כפי שמתואר במדריך של ערכת בידוד ה-RNA הכולל. הוציאו את דגימות הרקמה מהמקפיא בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והניחו את המבחנות ישירות על קרח יבש. הוסיפו 100 µL של תמיסת הליזיס והקישור למבחנה עם דגימה.
חבר עומס (pestle) המתאים למבחנה של 0.5 מיליליטר, נקי מנוקלאז, למערבל המשקעים והומוגנז את הרקמה באמצעות טיפ של פפיטה נקי מנוקלאז בעל שימור נמוך (low retention). העבר מיד את הדגימה ההומוגנית לבאר בלוח תרבית רקמה של 96 בארות בעלות תחתית עגולה באמצעות טיפ מאותו סוג. הוסף לדגימה 60 microliters של 100% isopropanol.
הוסיפו 20 µL מתערובת החרוזים לדגימה וערבבו על ידי שאיבה והזרקה (pipetting) של הנוזל שלוש עד ארבע פעמים. פעלו לפי השלבים בפרוטוקול של ערכה לבידוד total RNA כדי להשלים את חילוץ ה-total RNA. לבסוף, מדדו את הטוהר והריכוז של ה-total RNA שהתקבל. נתוני total RNA מדגימות של מיקרו-פאנץ' (micro punches) מאזורי מוח שונים מוצגים בטבלה זו.
דגימות RNA שהושרשו ב-30 µL של elution Buffer סיפקו כמות מספקת של RNA כולל לשימוש במוצרים מסחריים להכנת cDNA עבור יישומי ריצוף RNA. בנוסף, תובילי ה-RNA ויחסי 260/280 הם ערכים בודדים שהתקבלו מדגימות microdissection תואמות כדי להדגים קריאות שהתקבלו מכל אזור במוח, והם מאשרים טוהר דגימה גבוה. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-8 עד 10 דקות אם היא מבוצעת כהלכה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את הסיכון לזיהום RNA של משטחי העבודה או של דגימות הרקמה על ידי שימוש בחומרים נקיים מ-RNA או כאלה שעברו טיפול ב-DEPC.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול לאפיון ביטוי RNA באזורים נפרדים של מוח העכבר, תוך דגש על אסטרטגיה מדויקת וחוזרת לאיסוף רקמות. השיטה משלבת חיתוך קורונלי של המוח עם מיקרודיסקציה בעזרת דוקרן רקמות (tissue corer) כדי להפיק RNA כולל באיכות גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה מולקולרית
- פרופיל RNA
רקע
- פרופיל ביטוי RNA הוא חיוני להבנת תפקוד המוח.
- גרעיני מוח נפרדים דורשים דיסקציה מדויקת לצורך ניתוח מדויק.
- שמירה על סביבה נקייה מ-RNase חיונית לשמירה על שלמות ה-RNA.
- שיטות קודמות היו חסרות עקביות וחזרתיות.
מטרת המחקר
- ביסוס פרוטוקול מהימן למיצוי RNA מאזורי מוח של עכברים.
- הבטחת תנובה ואיכות גבוהות של RNA עבור יישומים המשכיים.
- סיוע באפיון הטרנסקריפטום באמצעות שיטות משופרות לאיסוף רקמות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת סביבת עבודה נקייה מ-RNase.
- ניתוק ראש והוצאת המוח השלם מהעכבר.
- חיתוך אחיד של רקמת המוח באמצעות קוצץ רקמות (tissue chopper) המופעל על ידי מיקרומטר.
- מיקרו-דיסקציה של אזורי מוח ממוקדים באמצעות ליבת רקמה בתווך נקי מ-RNA.
תוצאות עיקריות
- התקבלת תבואה גבוהה של RNA כולל מגרעיני המוח שבוצע להם דיסקציה.
- איכות ה-RNA אוששה כמתאימה להכנת ספריית cDNA.
- התוצאות תומכות בתועלת של השיטה לביצוע פרופיל טרנסקריפטום.
- בדיקות אישור הוכיחו כי איכות ה-RNA מספקת ליישומים המשכיים.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מספק גישה מהימנה להפקת RNA.
- הוא משפר את העקביות והאיכות של דגימות RNA מאזורי מוח של עכברים.
- שיטה זו מועילה למחקרים עתידיים במדעי העצבים הכוללים אנליזת RNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישת מיקרו-דיסקציה זו מאפשרת בידוד שחזר, בעל תפוקה גבוהה, של RNA כולל מאזורים מובחנים במוח העכבר, ובכך פותרת צוואר בקבוק מרכזי בתיקוף מטרות במדעי העצבים, שבו תפוקות נמוכות של RNA במיקרוסקופיית לכידה בלייזר (laser capture microscopy) מעכבות את אפיון הטרנסקריפטום. על ידי אספקת איכות RNA עקבית המתאימה לרצף מהדור הבא (next-generation sequencing), השיטה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) ומשפרת את הביטחון החזוי בתהליכי גילוי מוקדמים. היא מהווה חלופה ניתנת להרחבה וחסכונית למחקרי ביטוי גנים ספציפיים לאזורי מוח בהערכת מטרות פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות בידוד RNA מגרעיני מוח ספציפיים, כדי להקרין בין ביטוי של תסריטים (transcripts) לבין תפקוד של מעגלים עצביים ופנוטיפים התנהגותיים.
- ערך תפעולי: מספק איסוף דגימות הניתן לשחזור ובעל יעילות כלכלית ממספר אזורים נפרדים בכל עכבר, מה שמפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ומגביר את התפוקה לצורך הפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק RNA כולל בתשואה ובטוהר המספיקים לביצוע RNA-Seq ו-qRT-PCR בהמשך, מה שמאפשר פיתוח בדיקות מהימנות לסריקת ביטוי גנים במודלים של רקמת מוח.
- ערך תפעולי: משתמש בבידוד RNA מבוסס חרו지를 מגנט שמתאים לתהליכי עבודה בעתקת תפוקה גבוהה (high-throughput), ובכך תומך בסטנדרטיזציה לאורך קמפיינים של סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקל על ביצוע פרופיל טרנסקריפטומי רלוונטי למחלה במודלים של עכברים, בהלימה למאמצים לגילוי סמנים ביולוגיים תרגומיים בהפרעות נוירופסיכיאטריות ונוירודגנרטיביות.
- ערך תפעולי: מבטיח את שלמות ה-RNA באמצעות פרוטוקולים נקיים מ-RNase, ובכך משפר את השחזור במחקרים פרה-קליניים ארוכי טווח ואת היכולת להשוות נתונים בין מעבדות שונות.
שילוב בצינור עיבוד ובזרימת עבודה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות לגבי מטרות ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר פרופיל RNA מדויק של אזורי מוח מסייע בבחירת מטרות ותעדוף שלהן לפני תיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להשוואה טרנסקריפטומית בין אזורי מוח נפרדים הקשורים למעגלים עצביים ספציפיים.
- סריקה: מייצרת תשומות RNA סטנדרטיות המתאימות לסריקת ביטוי גנים כמותית, ובכך משפרת את השחזוריות במבחני מעורבות מטרה (target engagement).
- אנליטיקה: מייצרת RNA באיכות גבוהה לכימות ספקטרופוטומטרי ופלואורומטרי, מה שמאפשר נורמליזציה מדויקת של התשומות עבור יישומי ריצוף ו-PCR.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פרופיל ביטוי משלב הגילוי לרצף הפרה-קליני על ידי אספקת נתונים טרנסקריפטומיים רלוונטיים למחלה מאזורי מוח מוגדרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לבידוד RNA ואיסוף רקמות שניתן להשתמש בה שוב, והיא ישימה עבור פרויקטים של מדעי המוח ומחלקות מטרה מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית באמצעות נתוני ביטוי מדויקים הספציפיים לאזורי מוח.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות זרימות עבודה נטולות RNase וזמן עבודה ידני מינימלי (8–10 דקות לדגימה).
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להוצאת דגימות מאזורים מרובים מבעל חיים בודד, ובכך מפחית עלויות הקשורות לשיטות בעלות נבכיב נמוך הדורשות הגברה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם סיכון על ידי אספקת נתוני טרנסקריפטום מהימנים לצורך קבלת החלטות go/no-go בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולים ביישום
- נדרשת מומחיות בנוירו-אנאטומיה ובטכניקה נטולת RNase כדי לשמור על שלמות הדגימה במהלך הניתוח וההפקה של ה-RNA.
- תלוי בגישה לקיצץ רקמות (tissue chopper) המופעל על ידי מיקרומטר, למנקבי רקמות (tissue corers) בעלי קוטר קבוע, ולערכות בידוד RNA מבוססות חרוזי מגנט.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לסביבה נטולת RNase בין הצוותים השונים כדי להבטיח עקביות באיכות ה-RNA בין מחקרים שונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או למינים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קוטר דגימת הרקמה ושל פרמטרי החיתוך.
- מגבלה מעשית: ניקוב רקמות ידני עשוי להגביל יישומים בעלי תפוקה גבוהה במיוחד (ultra-high-throughput) בהשוואה למערכות לכידה בלייזר אוטומטיות, אם כי הוא מניב תפוקת RNA גבוהה יותר.
