תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את היישום של Flex Station three ללימוד הפרופיל הפארמקולוגי של תעלת ה-transient receptor potential או trip a one. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תאים המבטאים תעלות trip a one בלוחות מיקרוטיטר של 96 בארות.

לאחר שטיפת התאים בשוטף מיקרו-פלטות, התאים נטענים בצבע פלואורסצנטי הרגיש לסידן. לאחר תקופת טעינה של התאים ב-Flu oh 4:00 AM, מבוצעים מספר שטיפות נוספות. השלב הבא של הפרוטוקול הוא הכנת פלטת התרכובות, הכוללת אגוניסט של trip, a one ואנטגוניסט משוער של trip, a one.

כשלב סופי, פרמטרי התוכנה מוגדרים לקריאת המהלוח במערכת Flex Station three. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קשרי תגובה למנה עבור הפעלת trip A one על ידי flu phonemic acid, ועיכוב על ידי התרכובת האנטגוניסטית A. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנוני הפעלת 21 באמצעות מדידת זרימת סידן פנימה, ניתן ליישמה גם לחקר תפקודים של תעלות eye חדירות סידן אחרות ושל קולטנים המצומדים לחלבון G באמצעות צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן או צבעים של פוטנציאל ממברנה.

היתרון העיקרי של טקטיקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי סידן ומיפוי ידני של פאץ' (patch mapping), הוא שטכניקה חוסכת זמן זו מספקת סריקה בתופעת גבוהה לתפקוד ולמודולציה של נוסחאות סידן, תעלות ברזל וקולטנים אחרים המגייסים סידן. לפני תחילת פרוטוקול זה, גדלו תאי HEC 2 93 שעברו טרנספקציה יציבה עם trip A one לצפיפות של 70% עד 90% כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהכנת התאים לבדיקת הסידן, ציפו פלטות של 96 בארות על ידי פיפטור של 50 µL של poly L ornithine לכל בארה; הדגירו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות לפחות.

לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסת סליין בבפר פוספט (PBS) של KO. לאחר הטיפסין, העבירו את הכמות הרצויה של תאי HEC 2 93 למבחנה סטרילית עם תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים שנוצר.

בתוך מצע גידול DMEM מועשר ב-10% serum bovine fetal שעבר אינאקטיבציה בחום, העבירו 100 µL מתלי suspension התאים לכל באער של פלטת 96 באערים. באמצעות פיפט רב-ערוצי, השאירו את הפלטה במנדף למשך 30 דקות לפחות לפני העברתה לאינקובטור לתרביות תאים עם לחות למשך 20 עד 44 שעות. להכנת בדיקת הסידן, הכינו תחילה את התמיסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר ההכנה, ערבבו 10 µL של 1 mM flu oh 4:00 AM עם 10 µL של onic. F1 27, והעבירו את כל התוכן ל-5 mL של תמיסת באפר flu. Oh four assay המועשרת ב-0.1% bovine serum albumin.

בשלב הבא, שטפו את התאים שגודלו בפלטות של 96 בארות באמצעות HBSS בנפח של 80 µL לבערה, פעמיים, בעזרת שוטף מיקרופלטות. לאחר השטיפה, הוסיפו תמיסת טעינה של fluo-4B בנפח של 50 µL לבערה באמצעות פיפט רב-ערוצי, והדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. במהלך שעת טעינת התאים, הכינו סדרה של תמיסות agonist בריכוז 3x, סדרה של תמיסות antagonist בריכוז 3x, ונפח גדול של agonist בריכוז 300 µM בבאפר של בדיקת fluo-4.

העבירו 300 µL של תמיסות התרכובות המדוללות לפלטת תרכובות בעלת 96 בארות. סדרו את הדילול הסידורי של התרכובת ואת הביקורות החיוביות והשליליות המתאימות באותה עמודה של פלטת התרכובות במידת האפשר. כיוון שתחנת ה-Flex station three קוראת עמודה אחת בכל פעם, פלפטו 300 µL של תמיסת אגוניסט בריכוז 300 µM בסמוך לכל בארה המכילה את האנטגוניסט, כשלב סופי להכנת התאים.

שטפו את התאים שהועמסו שלוש פעמים עם בופר חומצה flu oh four באמצעות שוטף המיקרופלטה לאחר השטיפה האחרונה. השאירו 80 µL של בופר חומצה flu oh four בכל באר. כדי להתחיל בקריאת הפלטה, הפעילו את מערכת ה-Flex Station three והפעילו את תוכנת ה-soft max Pro 5.2.

שמרו את הניסוי תחת שם קובץ חדש בהגדרות. בחרו במצב flex והזינו את הפרמטרים למדידת השפעת האגוניסט והאנטגוניסט כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים חדשה, את פלטת התרכובות ואת פלטת הקריאה במגשים המתאימים של תחנת ה-flex. שלושה.

התחילו את קריאת הפלטה על ידי לחיצה על כפתור הקריאה (read) בתוכנת ה-Soft Max Pro. מכשיר ה-Flex Station three יקרא עמודה אחת בכל פעם ויוסיף תרכובות בנקודות הזמן שתוכננו מראש מבלי להפסיק את הקריאה. עם סיום ההרצה, ניתן לעבד את הנתונים הניסיוניים ישירות באמצעות תוכנת ה-Soft Max PRO או להעתיק ולהדביק אותם לכל תוכנת גיליון נתונים, כגון Microsoft Excel.

כדי לנתח את הנתונים, צור עקומות תגובה לריכוז עבור האגוניסט flu phonemic acid ועבור התרכובת המהווה אנטגוניסט משוער, באמצעות התאמה בריבוע הפחות (least squares fitting) כפי שמתואר בנוהל הכתוב. TRPA1 הוא תעלה לקטיונים חדירה לסידן, שהפעלתה מובילה להזרמת סידן שניתן לזהות באמצעות הצבע הרגיש לסידן fluo-4 AM. עקבות מייצגים של מהלכי הזמן של שינויי הפלואורסצנציה בתגובה לסדרה של ריכוזי flu phonemic acid או FFA מוצגים בריכוזים גבוהים יותר. FFA עורר עליות בפלואורסצנציה עם קינטיקה מהירה בהרבה מאשר בריכוזים נמוכים יותר, למרות רמות שיא דומות של פלואורסצנציה.

כדי להבחין בין הבדלים אלו, נבנה קשר של תגובה לריכוז על ידי מדידת קצבי העלייה הראשוניים של הפלואורסצנציה. לאחר הוספה של ריכוזים משתנים של FFA, נקבע הריכוז האפקטיבי החציוני (half maximal effective concentration) של FFA כ-55.4 micromolar. מוצג גם הקשר של תגובה לריכוז של עיכוב תגובת הסידן שגורם FFA על ידי תרכובת A, שהיא אנטגוניסט משוער ל-trip a one.

מינון הפחית באופן בלתי תלוי את התגובה של תאי trip A one ל-FFA עם ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי של 4.3 micromolar. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הפרופילים הפרמקולוגיים של triple A one ותעלות קשורות באמצעות ה-flag station three.