Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא שימור בהקפאה של עוברי עכבר בחנקן נוזלי והפשרתם לצורך השגת עכברים חיים. הדבר מושג תחילה על ידי טבילת עוברי העכבר במדיום הרגלה (equilibration medium), העברתם למדיום ויטריפיקציה בתוך מבחנה לקריו (cryo tube), ולאחר מכן הנחתם במיכל חנקן נוזלי. בשלב מאוחר יותר ניתן להפשיר את העוברים במדיום אוסמוטי גבוה ולהדגירה במדיום תרבית עד להעברתם לנקבות מקבלות.

בסופו של דבר, התוצאות מראות הישרדות של יותר מ-90% מהעוברים לאחר הפשרה מוויטריפיקציה, ושיעורי לידה שבין 30% ל-70% לאחר השאת עוברים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהקריו-פרוטקטנט החדיר glycol הוא פחות רעיל לעוברים מאשר קריו-פרוטקטנטים קונבנציונליים. טכנאי מהמעבדה שלי ידגים את הפרוצדורה לפני תחילת פרוטוקול זה.

הכינו שני עוברים של עכבר בשלב שתי התאים בתרבית, שהושגו באמצעות הזיווג טבעי או בטכניקות IVF קונבנציונליות, בתוך מבחנה להקפאה (cryo tube) לצורך אחסון עתידי, והוסיפו 50 µl של תמיסת הקפאת עוברים EF S 40. לאחר מכן, הכינו צלחת פטרי פלסטית של 35 מילימטרים או 60 מילימטרים עם 50 µl של EFS 20 בטמפרטורת החדר.

השתמשו בנימי זכוכית כדי להעביר עד 30 עוברים אל הצלחת. היזהרו להימנע מהעברת מדיום התרבית. כמו כן, כדי למנוע התייבשות של העוברים, מקמו אותם בתחתית הטיפה.

לאחר כ-60 עד 90 שניות, השתמשו בצינור קפילרי כדי לשאוב את העוברים המיובשים, בעלי מורפולוגיה מכווצת. העבירו עוברים אלו לתוך תמיסת EFS בתוך מבחנת הקריו, תוך העברת כמות מינימלית ככל האפשר של EFS 20.

לאחר העברת העוברים, יש לאפשר להם להתייצב ב-EFS 40 למשך דקה אחת לפני הקפאתם בחנקן נוזלי. לפני הפשרת העוברים, יש להניח בצלחת תרבית לפחות שתי טיפות של 10 µL של תמיסת תרבית עוברים בעלת אוסמולריות גבוהה, כגון תמיסת M 16. לאחר מכן, יש לכסות את הטיפות לחלוטין בשמן סיליקון או בשמן מינרלי, ולהניח את הצלחת באינקובטור פחמן דו-חמצני עד למועד השימוש.

בשלב הבא, חממו את תמיסת ה-TS one ל-37 °C תוך כדי חבישת מסכת פנים וכפפות קריו. הוציאו את העוברים ממיכל החנקן הנוזלי. כעת, פתחו במהירות את מבחנה הקריו ושפכו כל שארית של חנקן נוזלי בחזרה למיכל או למכל מתאים אחר.

לאחר מכן המתן 30 שניות. כעת הוסף 850 µl של תמיסת TS one חמה למבחנה לקריו. שאב והזרק בעדינות את התמיסה כ-10 פעמים כדי שתהיה מומסת באופן אחיד.

לאחר מכן, העבירו את כל הנפח לצלוחית פטרי פלסטית בקוטר 60 מילימטר או לזכוכית שעון. המתינו שלוש דקות עד שהעוברים יגיעו לשיווי משקל עם טמפרטורת החדר, שבה הם יישארו למשך שאר הפרוצדורה. אין להשתמש במכשיר חימום.

בחנו במהירות את העוברים בצלחת תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי להתרשם ממראם בתחילת דגירה זו. לאחר כד שתי דקות של דגירה, השקיעו את העוברים על ידי ניעור עדין של הצלחת עד שהתווך יתפשט על פני שטח הצלחת. בדקה האחרונה של הדגירה, הוציאו שלוש טיפות נפרדות של 50 µL מתמיסת TS two לתוך צלחת.

בסיום שלוש הדקות, השתמשו במיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שהעוברים התכווצו מעט. אם העוברים עדיין נפוחים, המשיכו את הדגירה למשך דקה עד שלוש דקות נוספות. כעת, הסירו את העוברים באמצעות קפילרה מזכוכית והעבירו אותם לטיפה הראשונה של TS two.

המתינו שלוש דקות והעבירו את העוברים לטיפה השנייה. לאחר מכן, העבירו אותם לטיפה השלישית. לבסוף, הוציאו מהאינקובטור את צלחת מצע גידול העוברים שהוכשרה, והשתמשו בקפילרית זכוכית כדי להעביר את העוברים לטיפה הראשונה של המצע.

בבדיקה תחת סטראוסקופ, העוברים אמורים להחזיר בהדרגה את המורפולוגיה התקינה שלהם. כעת, החזירו את הצלחת לאינקובטור למשך כ-10 דקות. לאחר מכן, שטפו את הסוכרוז שעבר מ-TS two.

העבירו את העוברים לטיפה הבאה של תוצר תרבית. המשיכו בגידול העוברים באינקובטור CO2 עד להעברתם ל-uc של נקבות רקבלנט. לאחר ויטריפיקציה והשבה של בין 300 ל-480 עוברים משלושה זני עכברים שונים, שיעור ההישרדות היה גבוה מאוד.

לאחר ההפשרה, שיעור העוברים שהראו מורפולוגיה תקינה היה בין 93% ל-99%, ומבין עוברים אלו לפחות 84% התפתחו לבלסטוציסטים. זכרו כי עבודה עם חנקן נוזלי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע מגע ישיר ולמזער חשיפה מקרוב לחנקן. יש להשתמש בחנקן תמיד תוך ביצוע נוהל זה.