עצמיים אבי האנדותל Cell-מתזמן טכנולוגיה בדיקה biocompatibility עבור התקנים לב וכלי דם במודל חיה גדולה
9 בספטמבר 2011
שיטה טיטניום זריעת דם biomaterials ליצור קשר עם תאים עצמיים ו biocompatibility בדיקות מתואר. שיטה זו משתמשת ובתאים אנדותל צינורות טיטניום, זורעים בתוך דקות של ניתוח ההשתלה לתוך חזירי venae cavae. טכניקה זו ניתנת להתאמה מכשירים רבים אחרים ביו מושתלת.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להזריע שתלים כלי דם בתאי אב אנדותליאליים המופקים מדם עצמי, ולאחר מכן לבחון את השפעת טיפול זה על תרומבוזה במודל של בעל חיים גדול. דבר זה מושג על ידי השגת דגימת דם פריפרית מחזירים כדי לבודד תאי אב אנדותליאליים של חזיר בעלי צמיחה מאוחרת (late outgrowth). לאחר מכן, מכשיר הניתן להשתלה.
במחקר הוכחת ההיתכנות שלנו, צינור הטיטניום מאוכלס בתאי PC אוטולוגיים. לאחר מכן, המכשיר מושתל ב-vena cava inferior של החזיר. התוצאות מראות הגנה מפני תרומבוזה, בהתבסס על הפתוחות (patency) של צינור הטיטניום המאוכלס בתאי EPC, לעומת קבוצת הביקורת וצינור המתכת החלק שנחסם.
הפקולטה לכירוגיה של Duke מחויבת לקידום מחקר פורץ דרך וחדשני. המצגת הבאה היא דוגמה לאופן שבו אנו פועלים בין מחלקות ודיסציפלינות כדי לקדם את הרפואה. ד"ר EK מוביל מאמץ מחקרי לפיתוח טכנולוגיית שיכון תאים שתמנע תרומבוזה על ידי ציפוי של פני השטח הבאים במגע עם הדם של מכשירים כלי דם בתאי אב של המטופל.
מכיוון שתאים אלו הופקו מאותם מטופלים שיקבלו את השתל, אנו מונעים דחייה על ידי מערכת החיסון. הצלחתנו והשיטות המתוארות כאן הן תוצאה של מאמץ צוותי רחב. השתלה כירורגית תודגם על ידי שון גייג' (Sean Gage) מהמחלקה לכירורגיה וסקולרית, וויטני ליין (Whitney Lane), סטודנטית לרפואה באוניברסיטת דיוק, ואנוכה.
אשמח כעת להציג את אלכסנדר יאנסן, דוקטורנט מהמחלקה להנדסה ביו-רפואית, שיוביל אותנו דרך תהליך זריעת התאים. אפגין בפירוט כיצד לזרוע צינורות טיטניום עם תאי אב אנדותליאליים המופקים מדם רגע לפני השתלה במודל של חזיר. שיטה זו משמשת כהוכחת היתכנות, ואת אותם עקרונות בסיסיים ניתן להחיל על מכשירים ניתנים להשתלה רבים אחרים, כגון סטנטים מניטינול ומכשירי סיוע למחזור הדם מכניים. EPCs מבודלים על ידי זריעת פראקציית התאים החד-גרעיניים של דם חזיר, ובדרך כלל מופיעים לאחר כשבעה ימים.
ניתן לזהות אותם לפי המורפולוגיה הטיפוסית שלהם, הדומה לריצוף של אבני ריצוף (cobblestone). הרחב את ה-EPCs למספר כולל של 9 מיליון תאים בתרבית. שטוף את ה-EPCs שהוכנו פעמיים במצע ללא סרום, תוך הקפדה להגביל את חשיפתם לאור במהלך הסימון ואחריו.
לאחר מכן, כסו את התאים בתג fluorescent, PKH 26, ורשמו את כמות התמיסה שהוחלה. דגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך ארבע דקות. עצרו את תגובת הסימון על ידי הוספת נפח שווה של סרום חזיר לתמיסת הצבע לאחר דקה אחת.
דללו את התמיסות המשולבות ביחס של אחד ለአחד עם מצע גידול מלא. לאחר מכן, שאבו את הנוזל ושטפו את התאים שלוש פעמים עם מצע גידול מלא, ולאחר מכן בשתי שטיפות עם DPBS ללא סידן או מגנזיום כלוריד. לאחר מכן, כסו את התאים בטריפסין תוך רישום הנפח שנעשה בו שימוש, והדגרימו אותם בטמפרטורה של 37 °C.
לאחר שלוש דקות של דגירה, השתמש במיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים ניתקו, ובמקרה זה, הוסף כמות כפולה של תמיסת נטרול טריפסין לעומת הכמות שהוספה בתחילה. לאחר נטרול הטריפסין, איחד את תמיסות התאים למבחנה אחת ומדוד את צפיפות התאים באמצעות המוציטומטר. לבסוף, השק תמיסת התאים ושחזר אותם בלפחות 4.5 milliliters של מצע ללא סרום.
לאחר הכנת החזיר לניתוח, בצעו חתך בקו האמצע באמצעות להב סקאלפל מספר 15 החל מערך בלוטות הזיכרון השני. התקדמו בזהירות לעבר מערך הבלוטות הלפני-אחרון באמצעות קוואטרסאציה (electrocautery). המשיכו בנתיחה עד לחשפת הפסציה הבטנית (abdominal fascia).
הרם את הפריטוניאום באמצעות פינצטת יתוש (mosquito forceps) והיכנס אליו בזהירות בעזרת מספרי מטזנדל (mets andal scissors), הוצא את שלפוחית השתן החוצה והנח תפר סביבי (purse string suture) מסוג Vicryl 3-0 בדופן השלפוחית. בצע חתך קטן במרכזו והחדר קטטר פולי (Foley catheter) במידה 16 French לתוך החתך. לאחר מכן, לתן נוזלים תוורידיים כדי לכוון את תפוקת השתן ללפחות 1 ml/kg/hour במהלך הניתוח.
בשלב הבא, הוצא החוצה את המעי המורחב והקטן והנח שני רטרקטורים כירורגיים של bour כדי לחשוף את ההיבט האחורי של חלל הפריטונאום, וזהה את ה-IVC באמצעות דיסקציה חדה ועמומה. שחרר בזהירות את ה-IVC מהרקמה שסביבו. לאחר מכן, בצע שלדון (skeletonize) לכלי הדם מהעורק הכליתי הימני, פרוקסימלית למפגש (bifurcation) של ה-IVC, עד לקצה הדיסטלי.
יש לנקוט בזהירות קיצונית במהלך נתיח ה-IVC, שכן אפילו פגם קטן מאוד ב-IVC עלול להוביל לדימום מהיר ולריקון דם של בעל החיים. יש לקשור את כל הענפים הצדדיים של מקטע ה-IVC; יש להקפיד במיוחד על נתיחה וקישור של שני ורידי המותניים האחוריים הגדולים, מיד פרוקסימלית למפגש ה-IVC. לעיתים קרובות קיים וריד מותניים גדול בצד האחורי.
נתיקו וחלצו וריד זה והשליטו עליו באמצעות לולאות כלי דם (vessel loops). כעת, במקביל לניתוח, התחילו בזריעה של EPCs על השבב לפני תחילת הליך זה. פיגומים להשבת רקמות של צינור טיטניום חייבים להיות מורכבים במלואם ומוכנים לשימוש בשטח סטרילי.
פתח את מכלול צינור הטיטניום שעומד בסטריליזציה בגז באמצעות מזרק של 5 cc. לאחר מכן, הסר את הבוכנה מהמזרק של ה-5 cc, אך אל תשלח אותה למחזור. הצמד מכסה קבוע למזרק. השתמש בפיפטה כדי למלא את המזרק בתרחיף ה-EPC.
לאחר מכן החזירו את הבוכנה. הסירו את הפקק והחדירו את קצה הפיתיון של המזרק לתוך צינור הסיליקון הפתוח של המכלול עד להגעה להתאמה הדוקה. אך אין להחדיר מעבר לכך. הסירו בועות אוויר על ידי דחיפה איטית של תמיסת התאים עד שהיא מגיעה לחלק העליון של ראש המכשיר.
לאחר מכן, סגרו את המערכת באמצעות פקק לור (lure cap) ואיטמו אותה בסרט דביק בתוך כפפה סטרילית. הכניסו את כל המערכת למחזיק מזרקים מעובד והניחו אותה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. השתמשו במד כדי לוודא שתאי ההשכבה נמצאים במפלס, והניחו למערכת להתרגב באינקובציה תוך סיבוב עדין.
המשך בניתוח מיד לאחר קשירת ה-IVC על ידי מתן 100 יחידות הפרין לקילוגרם חזיר. לאחר מכן, סגור מיד את ה-IVC באמצעות תפסנית בזווית של 45 מעלות באופן דיסטלי ב-IVC ובווריד המותני (lumbar vein), ולאחר מכן באופן פרוקסימלי. כעת, השתמש בלהב סקלפל מספר 11 ובמספרי פתוח כדי לבצע פתיחה אורכית של הווריד (venotomy) באורך של ארבעה סנטימטרים בין התפסניות הפרוקסימלית והדיסטלית.
רוקנו כל שארית דם מה-IVC ושטפו את הלומן הפנימי שלו באמצעות DPBS סטרילי. כעת, הכניסו לתוך ה-IVC את השתל המיושב בתאי EPC או ביקורת של מתכת חשופה, כדי למנוע מהתאים להתייבש ולהוציא אוויר. מלאו את ה-IVC ב-DPBS עם calcium chloride ו-magnesium chloride.
לאחר מכן, סגרו את ה-venotomy באמצעות תפר רציף של פרולין 4-0 והסירו סתימה פרוקסימלית אחת כדי לנקז אוויר מה-IVC באמצעות כמות קטנה של דימום לאחור. לאחר הדימום, הסירו את הסתימה הדיסטלית כדי לשמור על השתל במקומו. הצמידו תפר קיבוע (stay suture) לצינור ה-PVC העובר דרך דופן הווריד.
סגור את הפסציה באמצעות OPDS על מחט CT. סגור את המרווח התת-עורי בתפר רץ של Vicryl 2-0. לאחר מכן, סגור את העור באמצעות סיכות.
הזריקו עד 20 milliliters של 0.25%Marcaine תת-עורית לאורך אתר החתך וכסו את הפצע בגזה וב-tegaderm להרגעת הכאב. תנו flu Nixon ו-oxymorphone תת-עורית לפי הצורך. הפסיקו את ההרדמה, וכאשר החזיר יתעורר, החזירו אותו לכלובו במהלך שבעת הימים הבאים.
יש להעניק atri בכל 24 שעות כטיפול אנטיביוטי מונע, ולוודא שמדבקת ה-fentanyl שהוצמדה לפני הניתוח תישאר מודבקת למשך שלושה ימים בסך הכל. לאחר שלושה ימים, הוצאו שתלי צינור הטיטניום שהושתלו, והמשטחים הפנימיים נבחנו. תחת אורך גל של עירור של 550 nanometer, נמצאה שכבה רציפה של תאים המסומנים פלואורסצנטית בצינור אחר.
תאי החיתוכים נצבעו בנוסף במסמן להיב adherence של תאי אנדותל טבקיים כדי להנכיח את גבולות התאים. ניתן להשתמש במגוון רחב של צבעים בהליך זה. לעומת זאת, שתל צינור טיטניום חשוף נחסם לחלוטין בסביבת גזירה נמוכה פרו-תרומבוטית של הווריד החלול התחתון.
כפי שמוצג בתמונות A ו-C, צינור הטיטניום שבו הונחו התאים מוצג בתמונה B ונשאר נקי מקרישים לאחר פרוצדורת בידוד התאים עם דם שיאו. EPC מופיעים לאחר שבעה ימים בממוצע בתרבית. בעת ביצוע הפרוצדורה הכירורגית, חשוב מאוד לבצע שלד (skeletonize) של ה-IVC בזהירות ובעדינות, שכן אפילו קרע קטן ב-IVC או בענפיו הצדדיים עלול להוביל לדימום מאסיבי של החזיר. לאחר פרוצדורה זו, חומרים אחרים הבאים במגע עם הדם יכולים לעבור אנדותליזציה מהירה כדי למנוע תרומבוזה.
סטנטים ואסקולריים אנדותליאליים, לדוגמה, עם EPCs שלנו, מדמים את הריפוי הטבעי של דופן כלי הדם ועשויים למנוע היצרות חוזרת (re-stenosis) ותרומבוזה לאחר פריסם. טכנולוגיית ה-quick see שלנו תאפשר ציפוי של מכשירים תוך-כליים בתאי אב אנדותליאליים המופקים מדמו של המטופל בתוך דקות בחדר הניתוחים או במעבדת הצנתורים. בכך נמנעת תרבית exvivo ממושכת.
הזמן השהייה על המכשיר עצמו נמנע, והטכנולוגיה הופכת למעשית לצורך יישום בפרקטיקה הקלינית.
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לזריעה של חומרים ביו-חומרים מטיטניום הבאים במגע עם דם באמצעות תאי פרוגניטור אנדותליאליים (EPCs) אוטולוגיים, במטרה לשפר את התאימות הביולוגית. הטכניקה כוללת זריעה מהירה של EPCs לתוך צינורות טיטניום מיד לפני השתלה כירורגית בורידי הvenae cavae של חזירים, ומדגימה פוטנציאל עבור מכשירים ביו-רפואיים שמימים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- הנדסה ביו-רפואית
- כירורגיה וסקולרית
- טיפול תאי
רקע
- ניתן להפיק תאי פרוגניטור אנדותליאליים (EPCs) מדמו של המטופל עצמו.
- שימוש בתאים אוטולוגיים מפחית את הסיכון לדחייה חיסונית.
- תרומבוזה היא סיבוך משמעותי בהשתלות כלי דם.
- מחקרים קודמים הראו כי EPCs יכולים לשפר את התאימות הביולוגית של השתלים.
מטרת המחקר
- ב celu זריעת תאי EPC אוטולוגיים על שתלים וסקולריים.
- ב celu הערכת השפעת טיפול ב-EPC על תרומבוזה במודל של בעלי חיים גדולים.
- ב celu פיתוח טכנולוגיה לזריעת תאים המשפרת את ביצועיהם של מכשירים וסקולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של EPCs חזירים בשלב צמיחה מאוחר (late outgrowth) מדגימות דם פריפריאלי.
- זריעה של EPCs בתוך צינורות טיטניום לפני ההשתלה.
- השתלה כירורגית של צינור הטיטניום הזרוע ב-EPCs לתוך הווריד החלול התחתון של החזיר.
- הערכת תהליכי תרומבוזיס על בסיס הפתיחות (patency) של המכשיר המושתל.
תוצאות עיקריות
- הצינור מטיטניום שעליו נזרעו EPC הפגין הגנה מפני תרומבוזה.
- התוצאות הצביעו על שיפור בפתוחות בהשוואה לצינורות מתכת חשופים של קבוצת הביקורת.
- השיטה הדגימה היתכנות עבור התקנים להשתלה אחרים.
- שיתוף פעולה בין מחלקות שיפר את תוצאות המחקר.
מסקנות
- זריעת שתלי טיטניום עם תאי EPCs אוטולוגים היא גישה מבטיחה להפחתת תרומבוזה.
- ניתן להתאים טכניקה זו למגוון מכשירים ביו-רפואיים.
- נדרש מחקר נוסף כדי לייעל את השיטה ולהעריך תוצאות ארוכות טווח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו נותנת מענה לאתגר קריטי בפיתוח מכשירים קרדיווסקולריים: סיבוכים תרומבוטיים הנובעים ממשטחים מלאכותיים הבאים במגע עם דם. על ידי מתן אפשרות לזריעה מהירה של תאי EPC (תאי פרוגניטורים אנדותליאליים) אותולוגים על שתלי טיטניום מיד לפני ההשתלה, הטכנולוגיה מציעה דרך לשיפור הביו-תאימות ולהפחתת הסיכון לתרומבoze בבדיקות פרה-קליניות. הגישה תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מכשירים וסקולריים על ידי אספקת ציפוי אנדותליאלי בעל רלוונטיות פיזיולוגית המופק מהמטופל במודל של בעל חיים גדול, ובכך היא מגבירה את הביטחון בניבוי של הערכות מכשירים בשלביהם המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנונים תרומבוגניים באמצעות השוואה בין משטחי מתכת חשופים למשטחים שעליהם זרעו EPC בסביבה תרומבוגנית.
- ערך תפעולי: מספק מודל הניתן לשחזור להערכת יעילות האנדותליזציה והעמידות לתרומבוזה של חומרי ביו-מטריאל מועמדים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה של כיסוי אנדותליאל ופתוחות (patency) לצורך סריקה השוואתית של מכשירים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של נהלי זריעה והשתלה של EPC לתמיכה בהעברה של בדיקות בין מעבדות ברמת דיוק גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים היווצרות תפקודית של שכבת אנדותל ושמירה על פתוחות (patency) במודל בעלי חיים גדול בעל רלוונטיות קלינית.
- ערך תפעולי: מגשר בין הכנת תאים in vitro לבדיקת ביצועים in vivo, ובכך מאפשר קבלת החלטות על קידום הפיתוח בהתאם לסיכונים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי תמיכה בתיקוף ביולוגי מוקדם של חומרים למכשור קרבי לפני זיהוי המועמדים (leads) ואופטימיזציה פרה-קלינית.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על אסטרטגיות לנדוותלציה במטרה להפחית סיכון לתרומבוזה בעיצוב מכשירים.
- סריקה: מאפשרת הערכה סטנדרטית של שינויים פניים באמצעות נקודות קצה כמותיות של כיסוי אנדוותלי ופתוחות המכשיר.
- אנליטיקה: מספקת כימות מבוסס פלואורסצנציה של כיסוי EPC וחסימה תרומבוטית כמדדי השוואה מרכזיים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מקור תאים אוטולוגיים לבין ביצועי המכשיר במודל של IVC בחזירים, ובכך תומכת ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת אסטרטגיות נדוותלציה במגוון סוגי מכשירים (למשל, סטנטים, מכשירים לסיוע לבבי).
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את תיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית סביב אינטראקציות בין דם למכשיר.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד, סימון והזרעה של EPC.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים מוקדמים על עמידות לתרומבוזה, ובכך מפחית את הסיכון לכשל ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים למכשירים בהתבסס על פוטנציאל אנדותליזציה ופרופילי תאימות ביולוגית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתרביות תאים, סימון פלואורסצנטי וטכניקות של כירורגיה וסקולרית.
- תלוי בציוד לטיפול סטרילי בתאים, אינקובטורים ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לצורך תיקוף.
- מחייב סטנדרטיזציה רב-תחומית בין צוותי עיבוד התאים לצוותים הכירורגיים לצורך השתלה במועד.
- הסתגלות לביומטריאלים חלופיים (למשל, nitinol, פולימרים) עשויה לדרוש אופטימיזציה של שינוי פני השטח.
- מוגבל על ידי לוח הזמנים של התרבית ex vivo להרחבת EPC, אשר חייב להיות מתואם עם תזמון הניתוח.
