לדמיין חלבונים מכלולים Macromolecular על ידי א.מ. כתמים שליליות: החל הכנה רשת הרכישה תמונה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ויזואליזציה של דגימות חלבון מנוקות באמצעות מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת רשתות המיקרוסקופיה האלקטרונית שישאו את הדגימה. השלב השני של הפרוצדורה הוא הכנת תמיסת הצביעה השלילית.

בשלב הבא, הדגימה מועברת לרשת למיקרוסקופיה אלקטרונית ועוברת צביעה שלילית. לסיום, רשת ה-EM מוכנסת למיקרוסקופ אלקטרונים, ותמונות מוקלטות תחת תנאים אופטיים מתאימים. תמונות DEM בשדה בהיר (brightfield) קונבנציונלי הן בעלות ניגודיות גבוהה ופירוט חד, המציגות מקרו-מולקולות בודדות המפוזרות על רקע חלק.

מיקרוסקופיה אלקטרונית בצביעה שלילית היא שיטה פשוטה להדמיה של החלבון הנבחר. ניתן להשתמש בה כבדיקה שגרתית לבחינת החלבון המטוהר, הן לצורך ניתוח מבני והן לצורך בדיקות ביוכימיות וביופיזיקליות אחרות. כאן נדגים כיצד להכין דגימה בצביעה שלילית עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה, שכן חלק מהשלבים קשים ללמידה מתיאורים טקסטואליים ומאיורים. התחילו בשימוש בפיפטת זכוכית כדי להניח טיפה בודדת של collodion לתוך כלי כימי גדול עם מים, על פני השטח של המים. בעוד ה-collodion מתפשט, הוא עשוי ללכוד אבק מפני השטח של המים.

הסר והחלף שכבת פלסטיק מאובקת של קולודיון בטיפה חדשה. לאחר מכן, הנח בין 50 ל-100 רשתות EM אחת אחת על שכבת הפלסטיק הצפה, כאשר הצד המבריק פונה כלפי מטה. בחר רשתות של 400 mesh לצביעה שלילית שגרתית ובחר רשתות של 200 mesh.

לאיסוף תמונות של זוגות נטייה. בחרו פיסת נייר ללא קמטים בעלת ספיגה איטית, שגודלה מעט גדול משטח הגרידים. הניחו את הנייר מעל הגרידים והמתינו עד שהנייר יהיה רטוב לחלוטין.

הנייר לא אמור לספוג מים במהירות רבה מדי. אנו משתמשים בנייר מפנקס זול. הסריגים נמצאים כעת בין רדיד הפלסטיק לבין הנייר.

השתמשו בפינצטה כדי להניח את הנייר בתוך צלחת פטרי לייבוש איטי באוויר. הימנעו משיטות ייבוש מהירות יותר שכן הן עלולות לגרום לקמטים. מכונת ציפוי הפחמן שבה השתמשנו במעבדה שלנו היא Creston 2 0 8 C high vacuum turbo carbon coer.

מצויד במנטר עובי סרט של Creston. המנטר משתמש במאזן קוורץ הרגיש למשקעי פחמן. עם זאת, הפרוטוקול המתואר כאן אינו דורש מכשיר זה. התחילו בחידוד וטעינה של מוטות הפחמן במכונת ציפוי פחמן.

בשלב הבא, מרחו גריז ואקום על למסחית זכוכית, כך שחצי מהשטח המט יישאר ללא ציפוי. לאחר ציפוי הפחמן, יש להשתמש באזורים המגורזים של הלמסחית להערכת עובי ציפוי הפחמן. הניחו את הנייר עם הרשתות על הבמה תחת פעמון הזכוכית של מכונת ציפוי הפחמן. מקמו את זכוכית הגריז.

החליקו את השקופית לצד הסריגים. שאבו את תא הוואקום עד ללפחות 10 micro tours, אחרת פריקה חשמלית (sparking) תייצר חלקיקים גדולים רבים בסריג. כעת הגבירו את הזרם באיטיות רבה.

הקצה החד של מוט הפחמן יהפוך למאיר מאוד. אין להביט בו בעין בלתי מוגנת עם תחילת הציפוי; שקופית הזכוכית תשנה את צבעה לאפור כהה ככל ששכבת הפחמן נבנית. יש להפסיק את זרימת הזרם בעובי הפחמן הרצוי, תוך התחשבות בשקיפות של צנצנת הפעמון. כאשר מקבלים החלטה זו, ברגע שמידת הכהות של השקופית מכוילת לעובי הפחמן, שיטה זו מדויקת כמו נטור עובי סרט יקר יותר.

כאשר התהליך מסתיים, שחררו את הוואקום מתא הוואקום והוציאו את הסריגים המצופים לשימוש מאוחר יותר. שכבת הפלסטיק הדקה לא תשפיע על איכות התמונה בצביעה שלילית, אך ניתן להסירה על ידי השריה של הסריגים בכלורופורם למשך מספר שעות לפני ההמשך. הכינו תמיסת uranyl formate טרייה או השתמשו בתמיסה שאוחסנה בחושך למשך פחות משבועיים.

לתמיסה טרייה ותקינה יש צבע צהוב, pH של כ-4 והיא זורמת בצורה נקייה מאוד ללא משקעים. התחילו בשימוש במערכת זמינה מסחרית לביצוע Glow Discharge. בצעו פריקה של רשתות המצופות בפחמן.

בשלב הבא, הניחו שתי טיפות של 20 µL של מים מזוקקים ושתי טיפות של 25 µL של תמיסת פורמט משתן טרי על פיסת פריפיל (perfil). בעזרת פינצטה אנטי-קפילרית בעלת כוח דחייה, החזיקו רשת שעברה פריקה של מטענים חשמליים (glow discharged), כאשר הצד המצופה בפחמן פונה כלפי מעלה. נקודה קריטית היא שפינצטות אלו אינן שואבות נוזלים מהרשתות.

כעת יש להטיל שני µL של דגימת חלבון על הרשת ולהמתין עד שהחלבונים ייספגו בה. תהליך זה אורך בדרך כלל 30 שניות, אך דגימות מהוללות מאוד ידרשו זמן רב יותר, דבר שעלול להשפיע על ריכוזי הבאפר. בסיום, יש לספוג את שאריות דגימת החלבון באמצעות נייר סינון.

לאחר מכן, שטפו את הרשת פעמיים על ידי נגיעה קצרה של פני השטח שלה בטיפת מים וייבושה בטפיחות תוך מספר שניות. לאחר שהמים נגעו קצרות ברשת, געו בה בטיפת צבע וייבשו אותה במהירות בטפיחות. תוך שימוש באותה טכניקה, השאירו את הרשת במגע עם טיפה שנייה של צבע למשך 20 שניות.

לבסוף, ייבשו את הרשת באוויר תחת מנדף מעבדה, או רצוי בוואקום לפני מפגש ה-EM; בדקו את יישור מיקרוסקופ ה-EM והטעינו קובץ יישור אופטימלי אם זמין, דבר שאמור להחזיר אותו למצב כמעט מושלם. כעת, טענו את רשת ה-EM למחזיק דגימות סטנדרטי בעל הטיה בודדת. לאחר מכן, הכניסו את המחזיק אל הבמה.

לאחר מכן המתן לסיום מחזור השאיבה והכנס את המחזיק לתוך העמוד. כעת התחל בחיפוש אזור דגימה בעל צביעה טובה. בצע מיקוד ידני באמצעות שיטת הניגודיות המינימלית או על ידי שימוש במצלמה מסוג CC, D וחישוב ה-live four.

ספקטרום ההספק שלך. לאחר מכן הגדר את המיקוד העמוק (deep focus) לפי הצורך, בדרך כלל ל-1.5- מיקרון. ריכוז הצביעה עשוי להשתנות לאורך הרשת, לכן חפש חלבונים בעלי ניגודיות לבנה.

הימנעו מאזורים עם צביעה לא אחידה או צביעה חיובית שבהם הניגודיות של החלבון הופכת לשחורה. השתמשו בגישה המתוארת להכנת רשתות ולהדמיה של דגימות בצביעה שלילית. מספר חלבונים מוכרים הודגמו למטרות הדגמה.

שימו לב לפירוט ולניגודיות החדה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים דגימות של מקרו-מולקולות בצביעה שלילית לצורך תצפית במיקרוסקופ אלקטרונים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך כארבע שעות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון שחזור תלת-ממדי, על מנת להבין טוב יותר מבנים מולקולריים.