תפוקה גבוהה Saccharification Assay חומרים Lignocellulosic
3 ביולי 2011
שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.
שלום, אני קארה טד, אני ליאו. הגיע תורי. ואני סיימון מקווין מייסון.
ספיגביליות (digestibility) של ביומסה צמחית היא נושא בעל עניין רב בעת הנוכחית. זאת מכיוון שסוכרים רבים קשורים לפוליסכרידים של דפנות התאי הצמחי המרכיבים ביומסה זו, ואם נשכיל להפיק סוכרים אלו בצורה שמישה, נוכל להמיר אותם בתהליך תסיסה לייצור מגוון מוצרים, כגון דלקים וכימיקלים. למרבה הצער, חומרים אלו קשים מאוד לעיכול, ולהשגת הבנה טובה יותר של הגורמים השולטים בספיגביליות זו יש דחיפות רבה.
כדי שנוכל להשתמש בחומר צמחי לייצור קבוצת התחדשות, עלינו להיות מסוגלים למדוד את פוטנציאל ה-ification בצמחים אלו. לכן, כאן באוניברסיטת יורק, אנו סורקים אוכלוסיות גדולות של חומר צמחי כדי לקבוע את פוטנציאל ה-fication שלהן. Fication הוא התהליך של פירוק פחמימות מורכבות למרכיבי המונוסכריד שלהן כדי לייצר כימיקלים בעלי ערך באמצעות תהליכים תעשייתיים שונים.
כדי למדוד פוטנציאל סכריפיקציה, אנו משחזרים תהליכים תעשייתיים ברמת מיקרו, שבהם אנו מעבירים את הביומסה קדם-טיפול והידרוליזה אנזימטית כדי לקבוע את כמות הסוכרים ששוחררו. תהליך זה מאפשר לזהות זנים מעניינים בגנוטיפים. מערכת העיבוד בספיקה גבוהה פועלת בפורמט של פלטת IG בעלת שישה בארות.
תנאי הידרוליזה מתונים משמשים לחשיפת הבדלים דקים בין גנוטיפים, והם גמישים מספיק כדי לתמוך בחומרי מצע שונים וכן כדי להעריך אנזימים שונים. השיטה שבה אנו משתמשים כוללת עיצוב של חומר צמחי כאבקה, אשר עוברת לאחר מכן טיפול מקדים בחומצה או בבסיס מהולים ב-90 °C למשך 20 דקות. לאחר מכן, מבוצע עיכול אנזימטי באמצעות תערובת cellulase מסחרית ב-50 °C למשך שמונה שעות.
לבסוף, נעשה שימוש בשיטת MBTH כדי לקבוע את שחרור הסוכרים החמצוניים. חומר הצמח נאסף כגבעולים יבשים, הנחתכים למקטעים של ארבעה מילימטרים. אלו מונחים למבחנות בנפח של שני מיליליטר יחד עם שלושה כדורי מתכת בקוטר של חמישה מילימטרים.
המבחנות מסומנות באופן פרטני באמצעות ברקודים, שנסרקים כדי להבטיח את עקביות המעקב של הדגימות. הדגימות נטענות לתוך רובוטי הטחינה והעיצוב. הדגימות נטחנות ומעורבבות באופן אוטומטי כדי לאפשר חלוקה של הביומסה לתוך פלטה בעלת 96 בארות.
המבחנות ננקבות, ולאחר מכן המבחנה ממוקמת מחדש בזרוע הרובוטית כך שהיא נמצאת בתוך משפך הרוטט לפיזור האבקה. רעידות המשפך מנוהלות על ידי מאזניים כדי להשיג את הכמות המטרה של מסה לכל באר המופצת. הביומסה מופצת ל-10 עמודות בלוחיות, כאשר שתי עמודות נשמרות עבור סטנדרטים.
על ידי ביצוע ארבע חזרות לכל דגימה, אנו טוענים 20 דגימות לכל פלטה. את ההידרוליזאט של פלטה זו נחלק לשלוש פלטות PCR, מה שיניב שלוש פלטות אופטיות. בדרך זו, נקבל שלוש קביעות של סוכרים מרחזרים עבור כל באר של ביומסה.
לאחר העיצוב, הפלטות נאטמות באמצעות משטח סיליקון כדי למנוע התאיידות. כאשר הן מוכנות, הן מועברות לרובוט לטיפול בנוזלים. ברובוט לטיפול בנוזלים, טיפול מקדם, הידרוליזה אנזימטית וקביעת הסוכרים שהשתחררו מבוצעים באופן אוטומטי.
על השולחן באורך שני מטרים מונחים מכלים עבור הרכיבים השונים הדרושים, וכן שטח אחסון עבור כלי הפלסטיק. קיימים דגריטורים לשלב הקדם-טיפול ולהידרוליזה, וכן תרמוסייקלרים לקביעת כמות הסוכר. הקדם-טיפול מבוצע בפלטת בארות עמוקות.
על ידי הוספת תמיסות חומצה או בסיס מהולות לאבקת הביומסה. את הפלטות מעבירים לבלוק חימום ומדגירים בטמפרטורה של 90 °C למשך 20 דקות. עם סיום הדגירה, מסירים את חומרי הקדם-טיפול על ידי שטיפה חמש פעמים עם 500 µL של בופר אצטט.
לאחר שטיפת טיפול המקדם, מוסיפים תערובת אנזימים. זוהי תערובת סטנדרטית. היא מכילה cellulose ו-novozyme 1, 8 8 ביחס של ארבעה לאחד בריכוז של 7 FPU למערכת (well).
את המצעים מדגירים במשך שמונה שעות ב-50 °C תוך כדי ניעור. 75 µL מההידרוליזאט שהתקבל מועברים לפלטת PCR. בעמודות 11 ו-12 של פלטות ה-PCR מוסיפים את תמיכדי הגלוקוז.
בשלב הבא, מוסיפים 25 µL של נתרן הידרוקסיד בריכוז 1 M לכל הבארות. לבסוף, טפטף 50 µL של ריאגנט MBTH לתוך לוחית ה-PCR. לוחית הבארות העמוקות נשמרת לאחר השלמת העברת ההידרוליזט ללוחית ה-PCR השלישית.
בעוד שפלטות ה-PCR מועברות למכשיר הטרמוסייקלר לדגירה ב-60 מעלות למשך 15 דקות. השלב האחרון של התהליך הוא העברה של תערובת התגובה לפלטות אופטיות לצורך פיתוח הצבע. לאחר הדגירה, פלטות ה-PCR מוצאות מהטרמוסייקלר.
מאה µL של ריאגנט מחמצן מתווספים לתערובת התגובה שהועברה. כדי להקל על פיתוח הצבע, תהליך טיפול בנוזלים מבוצע ארבע פעמים בתוך 24 שעות, כאשר שטיפת הקדם-טיפול והוספת האנזים אורכות כשעתיים. ההידרוליזה האנזימטית נמשכת שמונה שעות, וקביעת כמות הסוכר אורכת שעתיים נוספות.
בזמן שהפלטה הראשונה מדגגרת במשך שמונה שעות, הפלטה הבאה מתחילה בתהליך. באמצעות הקצאה זו של משאבי הרובוט, מושג תפוקת של 80 דגימות ליום כדי לקבוע את כמות הסוכרים החמצניים ששוחררו. הפלטות האופטיות נקראות באורך גל של 620 nanometers.
התוצאות המתקבלות מנותחות כדי לכמת את סוכרי השחרור כננומול למילגרם לשעת תגובה. תודה שצפיתם, ואני מקווה שסרטון זה יעניק השראה למחקריכם בתחום הדלקים הביולוגיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מהירה להערכת פוטנציאל הסכריפיקציה של דגימות שונות של ביומסה צמחית באמצעות פלטפורמה אוטומטית. התהליך כולל קדם-טיפול, הידרוליזה וכמותיות של סוכרים משוחררים בפורמט של תפוקה גבוהה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של הצומח
- המרה של ביומסה
- אנרגיה מתחדשת
רקע
- ביומסה של צמחים מכילה סוכרים בפוליסכרידים שקשה לעיכול.
- הבנת יכולת העיכול היא קריטית לניצול חומר צמחי לייצור דלקים מתחדשים.
- המחקר מתמקד בקביעת פוטנציאל הסכריפיקציה של גנוטיפים שונים של צמחים.
- סריקה בתופעת גבוהה (High-throughput screening) יכולה לזהות זנים מבטיחים ליישומים תעשייתיים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למדידת פוטנציאל הסכריפיקציה (saccharification) של ביומסה צמחית.
- סיוע בהפקת סוכרים לתהליכי תסיסה לייצור דלקים וכימיקלים.
- שיפור ההבנה של הגורמים המשפיעים על יכולת העיכול של הביומסה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- ביומסה של צמחים עוברת טיפול מקדים באמצעות תמיסות חומציות או בסיסיות.
- הידרוליזה אנזימטית מבוצעת באמצעות תערובת צלולאז מסחרית.
- סריקה בתופעת גבוהה (High-throughput screening) מבוצעת בפורמט של פלטת 96 בארות.
- סוכרים מחזרים נמדדים כמותית באמצעות שיטת MBTH לאחר ההידרוליזה.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת הערכה מהירה של פוטנציאל הסכריפיקציה במספר דגימות.
- ניתן לזהות הבדלים דקים בעיכול בין גנוטיפים שונים.
- התהליך האוטומטי מגדיל את התפוקה ומאפשר ניתוח של 80 דגימות ליום.
מסקנות
- השיטה שפותחה יעילה לסריקת ביומסה של צמחים עבור יישומים תעשייתיים.
- היא מספקת תובנות לגבי העיכוליות של חומרי צמחים שונים.
- גישה זו יכולה לסייע בבחירת זני צמחים לייצור דלק ביולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות סכריפיקציה (saccharification) בתפוקה גבוהה מאפשרות הערכה כמותית ומהירה של יכולת העיכול של ביומסה ליגנוצלולוזית, המהווה צוואר בקבוק קריטי באופטימיזציה של חומרי גלם לביו-רפיינרי. פלטפורמה זו תומכת בסינון בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת שונות תלוית-גנוטיפ בשחרור הסוכרים. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החזויית לבחירת חומרי גלם ולפיתוח תהליכים בשרשראות אספקה של ביוטכנולוגיה תעשייתית.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה שיטתית של גורמי העמידות והעיכול של דופן התא הצמחי.
- תומך בזיהוי של וריאנטים גנטיים או זני רבייה בעלי פרופילי סכריפיקציה (saccharification) משופרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי כימות השפעת הרכב דופן התא על שחרור סוכר.
- מספק מיון מבוסס נתונים לקידום חומרי גלם בפורטפוליו של דלקים וכימיקלים מתחדשים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק מדידות סכריפיקציה סטנדרטיות וניתנות לשחזור על פני מערכי דגימות גדולים.
- מבצע אוטומציה של הכנת דגימות, טיפול מקדים והידרוליזה אנזימטית בפורמט של 96 בארות.
- מפיק פלטים כמותיים (סוכרים מחזרים) המתאימים לניתוח השוואתי ולסריקה המשכית.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה של פורמולציות אנזימטיות וסוגי סובסטראטים לצורך אופטימיזציה של תהליכים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים של עיכול במכנה של מעבדה לתנאי תהליך תעשייתיים לצורך רלוונטיות תרגומית.
- תומך ברציפות משלב סריקת הגנוטיפ ועד לתיקוף חומרי גלם פרה-קליניים בפיתוח ביו-רפיינרי (biorefinery).
- מפחית את הסיכון לכשיל תהליכים בשלבים מאוחרים באמצעות אספקת מדדי עיכול חזויים בשלב מוקדם של תהליך העבודה.
אינטגרציה של צינור עיבוד וזרימת עבודה
בדיקה זו, בעלת תפוקה גבוהה, משתלבת ברצף שבין הגילוי לפיתוח של חומרי גלם מתחדשים, ומגשרת בין סריקת גנוטיפים מוקדמת לבין תיקוף תהליכים פרה-קליני.
- ביולוגיה של התגליות: מכמת את פוטנציאל הסכריפיקציה כדי להבהיר צווארי בקבוק ביולוגיים בפירוק דופן התא.
- סריקה: מספק תוצאות בדיקה בעלות סבירות גבוהה ובתפוקה גבוהה להערכת גנוטיפים ואנזימים.
- אנליטיקה: מספק נתוני שחרור סוכר ביחידות של nanomole/mg/hour להשוואה סטטיסטית חסונה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פרופילי עיכול במעבדה לדרישות של ביו-זיקוק תעשייתי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה אוטומטית וניתנת להרחבה, הניתנת להתאמה למיני צמחים ומערכות אנזימים מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בבחירת חומרי גלם ובתכנון התהליך.
- ערך תפעולי: מתקנן זרימות עבודה, משפר את השחזוריות ומאפשר סקילביליות של תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור קידום חומרי גלם ואופטימיזציה של אנזימים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של גנוטיפים ותנאי תהליך עבור צינורות ייצור בביוטכנולוגיה תעשייתית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביולוגיה של דופן התא הצמחי ובניתוח הידרוליזה אנזימטית.
- תלוי בתשתיות של טיפול אוטומטי בנוזלים, טחינה ומכשור אנליטי.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים להכנת דגימות וניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה למיני צמחים ותערובות אנזימים שונות באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- התפוקה והשחזוריות תלויות בהקצאת משאבים רובוטיים ובתחזוקתם.
