יום אחד זרימת עבודה עבור תוכנית זיהוי פתוגן חיידקי ובדיקות ההתנגדות Antimicrobial מתרבויות דם

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות ולהעריך רגישות לאנטיביוטיקה של בידודים מתרביות דם בזמן קצר יותר מאשר בשיטות קונבנציונליות. הדבר מושג תחילה על ידי זיהוי הבידוד מתרבית הדם, באמצעות בדיקת MultiPro PCR חדשנית של DNA ריבוסומלי 16s.

לאחר מכן, מדגריים את הבידוד עם פאנל של אנטיביוטיקה למשך שש שעות. השלב הבא הוא קביעת הצמיחה או עיכוב הצמיחה של הבידוד בנוכחות האנטיביוטיקה באמצעות בדיקת quantitative 16 s ribosomal D-N-A-P-C-R. בסופו של דבר, התוצאות מראות כי ניתן להשיג זיהוי ובדיקת רגישות לאנטיביוטיקה של בידוד מתרבית דם במהירות רבה יותר באמצעות שילוב זה של תרבית ו-PCR.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלו המשתמשות במערכות phoenix או IIC אוטומטיות, הוא שאין צורך במצב תרבית מוקדם, ותוצאות הזיהוי ובדיקות הרגישות לאנטיביוטיקה יכולות להיות זמינות באותו היום. את הפרוצדורה ידגימו Vandy Hanson ו-GID, סטודנטים לדוקטורט מהמעבדה שלנו. דללו 100 µL של תרבית דם חיובית לצמיחה מיקרוביאלית במבחנה המכילה 900 µL של 0.9% sodium chloride. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 13,400 ×g למשך חמש דקות כדי לשקיע את החיידקים לאחר הסבוב.

ריס, השהה את המשקע ב-100 µL של מים דה-מינרליים סטריליים. שמור את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C עד לשימוש הבא. לאחר שכל הדגימות מוכנות, הכן את תערובות התגובה של real-time PCR להגברה של 16 s ribosomal DNA ספציפי מהחיידקים הרלוונטיים.

השתמש במים דמינרליזים כדי להביא את הנפחים ל-20 µL לכל תגובה. חלק 20 µL של תערובת PCR לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. לאחר מכן, הוסף 5 µL של דגימה לכל באער ואטום את לוח ה-PCR.

בשלב הבא, הרץ את ה-PCR במערכת real-time PCR מדגם A BI Prism 7, 900 HT כדי לנתח את התוצאות. עם השלמת ה-PCR, השתמש תחילה בלשונית הגדרות הניתוח (analysis settings) כדי להתאים את ניתוח ה-CT ל-0.1. לאחר מכן, הגדר את טווחי קו הבסיס (baseline) כך שיתחילו במחזור 6 ויסתיימו במחזור 15. רשום את ערך ה-CT עבור כל דגימה.

ניתן לקבוע בדרך כלל את ערך הסף להגדרת תוצאת PCR כחיובית כערך CT של 35. בדוגמה זו, מוצג פרופיל הזיהוי של תרבית דם נגועה ב-e coli בשני תערובות תגובה. נעשה שימוש בפריימרים אוניברסליים ל-16 s ribosomal DNA, אשר הניבו שתי עקומות הגברה בערכי CT של 25.2 ו-25.95.

עקומת ההגברה השלישית נגזרת מהגשוש הספציפי ל-Coli. גשושים ספציפיים אחרים לא יצרו אותים שניתן לזהות. לאחר שזוהה הפתוגן, ניתן לבצע בדיקות לאנטיביוטיקה.

התחילו בהעברה של חמישה מיליליטר של ציר מתרבית דם חיובית לתוך שפופרת עם מפריד סרום. סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 2000 times G למשך 10 דקות; לאחר הסבב, השליכו את התמיס העליון מהשפופרת. לאחר מכן, באמצעות מקלון צמר סטרילי, העבירו את החיידקים משכבת הג'ל של השפופרת לתוך 0.9% sodium chloride עד לקבלת תמיסה בעכירות של סטנדרט 0.5 McFarland.

זהו ערך התואם לכ-1.5 times 10⁸ יחידות יוצרות מושבות למילילטר. לאחר מכן, דללו את התרחוף במוצג מולר-הינטון (Muller Hinton) בריכוז כפול, כדי להגיע לריכוז של כ-5 times 10⁵ יחידות יוצרות מושבות למילילטר.

העבירו מנקב (Aliquot) של 50 µL לכל באער של התמיה לתוך פלטת מיקרוטיטר המכילה כבר 50 µL לכל באער של מבחר אנטיביוטיקה. הקפידו לכלול בקרים חיוביים לצמיחה עבור כל דגימה באמצעות באערים עם מים במקום אנטיביוטיקה. כסו את הפלטה בסיום הפעולה.

לאחר מכן, דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שש שעות כדי לאפשר צמיחה בקטריאלית. הקפידו לשמור מנה (aliquot) של התרחופה הבקטריאלית בטמפרטורה של 4 °C כביקורת לצמיחה שלילית. לאחר דגירה של שש שעות, העבירו את התוכן של כל באר ואת דגימת הביקורת השלילית לשפופרות סטריליות נפרדות.

לאחר סבב צנטריפוגציה של חמש דקות ב-16,000 ×g, הסירו 80 µL מהנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקעים (pellets) ב-80 µL של מים דה-מינרליזים סטריליים. דללו את הדגימות ביחס של 1:10 במים לפני השימוש בהם ל-real-time PCR של 16s ribosomal DNA.

הכינו את תערובת ה-PCR באמצעות IQ cyber green super mix ופריימרים ל-16 s ribosomal DNA, וחלקו 20 µL לכל באער בלוח PCR בעל 96 באערים. לאחר מכן, הוסיפו 5 µL מכל דגימה לבאערים ואטמו את הלוח.

בשלב הבא, בצעו PCR כדי לנתח את התוצאות. ראשית, חשבו את ערך ה-CT של נקודת החיתוך (cutoff). באופן כללי, ה-CT של נקודת החיתוך שווה ל-CT של בקרת הצמיחה החיובית בתוספת 0.5 כפול ה-CT של בקרת הצמיחה השלילית פחות ה-CT של בקרת הצמיחה.

עם זאת, עבור piperacillin עם tazobactam ו-CEF dazadi במקלות גראם-שליליים, וכן עבור amoxicillin, oxacillin ו-trimethoprim עם sulfamethoxazole ב-staphylococcus aureus או עבור amoxicillin ב-enterococcus SPP, יש להפחית את מקדם ההכפלה מ-0.5 ל-0.25. ניתן לקבוע את הרגישות או העמידות של הזנים בכל דגימה על ידי השוואת ה-CT של הדגימה ל-cutoff ct.

ערך CT שמעל סף הגזירה מעיד על רגישות, בעוד שערך CT מתחת לסף הגזירה מעיד על עמידות. לפניכם דוגמה לגרף הגברה של רגישות לאנטיביוטיקה. זן ה-e coli שזוהה קודם לכן נבדק לרגישות למספר אנטיביוטיקות, כאשר כל אחת מהן מיוצגת על ידי עקומה נפרדת.

דגימות עם ערך CT נמוך הן דגימות שבהן התרחשה צמיחה בנוכחות אנטיביוטיקה, מה שמעיד על עמידות לאנטיביוטיקה שנבדקה. לעומת זאת, ערך CT גבוה מייצג דגימה שבה לא התרחשה צמיחה, מה שמעיד על רגישות לאנטיביוטיקה שנבדקה. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו תוך תשע שעות אם היא מבוצעת כראוי.