גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק צאצאים נוירונליים באופן ישיר ובלעדי מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים באמצעות השראה באמצעות מולקולות קטנות. דבר זה מושג על ידי הוספת רטינואית לתאים לא מובחנים המתוחזקים תחת תנאים מוגדרים. לאחר מכן, תהליך הבידול נמשך על ידי ניתוק התאים לתרבית סספנסיה, שבה הם יוצרים צבירי תאים צפים הנקראים נוירובלסטים.

אם מאפשרים לנוירובלסטים להיצמד לפלטת תרבית רקמה במצע דיפרנציאציה עצבית, הם מפתחים מאפיינים של נוירונים בוגרים. בסופו של דבר, ניתן להשתמש באימונופלואורסצנציה ובמיקרוסקופיה של דקונבולוציה או מיקרוסקופיה קונפוקאלית כדי להראות את השפעת הטיפול ב-rettino acid על המורפולוגיה ועל ביטוי סמנים של תאי גזע עובריים אנושיים מטופלים. בטכניקות אחרות, רק חלק קטן מהתאים מאמצים פנוטיפ נוירונלי, בעוד ששיטתנו מאפשרת השראה יעילה ומבוקרת היטב של תאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים באופן בלעדי לעבר שושלת נוירונלית באמצעות אספקה פשוטה של מולקולות קטנות.

ישנם מספר שלבים שדורשים זהירות בעת הכנת תמיסות סטוק. יש להקפיד על הפשרה איטית של matrigel ושל human laminin מ-minus 80 degrees Celsius ל-four degrees Celsius במהלך הלילה; יש לאחסן את המצע ב-four degrees Celsius ותמיד לחמם את המצע ל-37 degrees Celsius לפני השימוש. כמו כן, בעת הכנת מצע human ESL, חלק מהתוספים מתווספים רגע לפני השימוש.

אלה כוללים BFGF, חומצה אסקורבית, human insulin active in A ו-transferring. לאחר מכן, הכין את תמיסות העבודה של ה-matra gel או ה-human laminin מיד לפני ציפוי הפלטה. דגרו את הפלטות ב-37 °C ב-5% carbon dioxide לאחר שהפלטות לתרבית רקמות המצופות מראש בג'לטין מוכנות.

ניתן להחליף את הג'לטין בתמיסה פעילה של matrigel או laminin. יש לצפות את הפלטות הללו על ידי דגירה למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. התחילו במתן אפשרות למושבות תאי ES אנושיים לגדול במשך חמישה עד שבעה ימים, ולאחר מכן הכינו אותם לפיצול.

בחר קולוניות שבהן יותר מ-75% מתאי ה-ES האנושיים אינם מובחנים; הן בדרך כלל מעט עכורות עם קצוות מוגדרים ומכילות תאים שנערמו זה על זה. סימן לתחילת בידול הוא הופעת קולוניות לבנות המכילות בעיקר תאים מובחנים, אשר נראות בדרך כלל שקופות. אין לבחור קולוניות לבנות או שקופות.

החזיקו את הצלחות מול מקור אור והשתמשו בטוש כדי לסמן את קווי המתאר של המושבות העכירות מעט בתחתית הצלחות. השתמשו בקצה של טיפ פפטה P2 סטרילי כדי להפריד את שכבת הפיברובלסטים שמקיפה את מושבת תאי ה-ES האנושיים. לאחר מכן, הסירו את תאי הפיברובלסטים שמסביב וכן את כל החלקים המובחנים (differentiated) של המושבה.

כעת שאבו את המצע הישן המכיל את התאים המובדלים שהסתלקו. לאחר מכן, שטפו בכל באר את התאים הבלתי מובדלים פעם אחת עם מצע תאי E es אנושיים ללא BFGF, ולאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע ESL אנושי טרי המכיל B-F-G-F-B-F-G-F, אשר מתווסף למצע הטרי מיד לפני השימוש. כעת השתמשו בטיפ של פיפט P two סטרילי כדי לחתוך את המושבות לחתיכות קטנות ולהפריד אותן מהפלטה.

העבירו את חלקי המושבה שהסורקו יחד עם המצע שלהם למבחנה קונית של 50 milliliter. בצעו שטיפה נוספת של 1 milliliter מצע לכל באר.

התאים מוכנים כעת לדיפרנציאציה נוספת באמצעות מולקולות קטנות. התחילו בחימום של פלטות שעברו ציפוי טרי ל-37 °C. שאבו את תמיסת הציפוי מהפלטות והוסיפו לכל באר מנת aliquote של 4 mL של מצע המכיל חלקי מושבות, ולאחר מכן העבירו בעדינות את הפלטות לאינקובטור ללא ניעור.

אין להפריע לצלחות כדי לאפשר לתאים להיקלט. לאחר שלושה ימי קליטה, הכינו מצע גידול חדש המכיל omic acid. לאחר מכן, הסירו את רוב מצע הגידול הישן, והשאירו כמות מספקת של מצע כך שהתאים יישארו טבולים.

אין לאפשר לתאים להתייבש בתוך כל באר. יש להוסיף 4 mL של מצע טרי לתאי ES אנושיים עם BFGF וחומצה רטינוית. יש להחליף את המצע בכל יום שני, ולאפשר למושבות תאי ES אנושיים שטופלו בחומצה רטינוית לגדול.

לאחר שבעה או שמונה ימים, התאים יעברו שינויים מורפולוגיים לתאים מובחנים גדולים. לאחר מכן, התקדמו ליצירת תרבית תאים בסספנסיה; כדי ליצור תרבית בסספנסיה, התחילו בהפרדת מושבות ESL מתאים שעברו בידול ספונטני ונדדו החוצה כדי ליצור שכבת פיברובלסטים. השתמשו בטכניקה שהוזכרה לעיל עם קצה של פיפטה סטרילית, ולאחר מכן שאבו את המצע הישן המכיל תאי פיברובלסטים מנותקים הצפים במצע.

שטפו את התאים פעם אחת עם מצע HESC ותלו אותם מחדש בשלושה מיליליטר של מצע HESC. כעת, באמצעות טיפ של פיפט P2 סטרילי, חתכו את המושבות לחתיכות קטנות ונתקו אותן מהצלחת.

העבירו את המצע עם המושבות המנותקות לשפופרת קונית אחת של 50 milliliter. שטפו את הבארים עם milliliter אחד של מצע והוסיפו את השטיפה למאגר. לאחר מכן, חלקו aliquots של four milliliters מהתאים המאוגדים לכל באר של פלטת שש באערים בעלת הידבקות נמוכה במיוחד (ultra-low attachment) למשך ארבעה עד חמישה ימים, והניחו את הפלטה באינקובטור.

במהלך זמן זה, ייווצרו צבירים תאיים צפים או נוירובלסטים (neuroblasts) על מנת לקדם את הנוירובלסטים לפנוטיפ נוירונלי בוגר יותר. העבירו את המצע המכיל אותם לשפופרת קונית של 50 milliliter. לאחר מכן, סובבו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1,400 RPM למשך חמש דקות.

שאבו את המצע הישן, שקלו כמות גדולה ככל האפשר ממנו והוסיפו כמות שווה של מצע NSC טרי המכיל VEGF N NT three ו-BDNF. ערבבו את התאים לתליה באמצעות פיפטינג, ולאחר מכן חלקו ארבעה milliliters של התליה לכל באר בלוחיות תרבית רקמה של שש בארות. העבירו את הלוחיות לאינקובטור לח בטמפרטורה של 37 °C.

הנוירובלאסטים ייצמדו לפלטות התרבית במהלך הלילה לתרבית תלת-ממדית באמצעות הוספת Matrigel או למינאט אנושי לתמיחת הנוירובלאסטים. המטריצה התלת-ממדית תעבור פולימריזציה בטמפרטורה של 37 °C. יש להחליף את המצע בכל יום שני.

בתוך שבועיים, יופיעו רשתות נרחבות של תאים עצביים הנושאים נוריטים ותאים פיגמנטיים; רטינואיד נמצא כמספיק כדי להוביל תאי ES אנושיים המתוחזקים במערכת תרבית מוגדרת לעבור ממצב של פלוריפוטנציות באופן בלעדי לפנוטיפ נוירו-אפידרמלי. עם חשיפת תאי ES אנושיים לא מובחנים לרטינואיד, כל התאים במושבה עברו שינויים מורפולוגיים לתאים מובחנים גדולים שהפסיקו לבטא את הסמן OCT four הקשור לפלוריפוטנציות. התאים החלו לבטא גם סמנים שונים הקשורים לנוירואקטודרם, כגון HNK one a, P two ו-TRKC.

תאים מובחנים גדולים אלו המשיכו להתרבות והמושבות גדלו בגודלן, תוך ביטוי ספונטני של הסמן העצבי המוקדם beta three tubulin. הסמן העצבי הבשל יותר map two החל להופיע באזורים במושבות שבהם התרחשה הצטברות של תאים. במקביל להופעתם של תאי הנוירואקטודרמה, גורם השעתוק הספציפי לנוירונים NER one, המעורב בבידול של נוירונים דופמינרגיים ובהפעלת הגן של tyrosine hydroxylase, עבר לגרעין.

לאחר ההפרדה, תאי ES אנושיים שטופלו בחומצה רטינואית יצרו נוירובלסטים בתרבית סוספנסיה עם הסרת bFGF, ולאחר מתן אפשרות לנוירובלסטים להיצמד לפיתח תרבית רקמה, החלו להופיע רשתות נרחבות של תאי עצב בעלי נוריטים ותאים פיגמנטריים, האופייניים למערכת העצבים המרכזית (CNS), עם עלייה דרמטית ביעילות, וניתן היה לגדלם במשך למעלה משלושה חודשים. תאי עצב אלו, שהופקו מתאי ES אנושיים, ביטאו beta three tubulin בהשוואה לדיפרנציאציה ספונטנית רב-שורה של תאים ללא טיפול בחומצה רטינואית, וביטאו במקביל map two. לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן להשתמש בה כדי להפיק פרוגניטורים עצביים ותאי עצב באופן אחיד מתאי גזע עובריים אנושיים פלוריפוטנטיים תוך כארבעה שבועות, במידה והיא מבוצעת כראוי.

זכרו כי עבודה עם תאי אדם עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון וידוא שקווי התאים נקיים מפתוגנים וממיקופלסמה, לפני ביצוע הליך זה.