הטרוגניות מיפוי של ביטוי חלבון בתוך גידולים באמצעות immunofluorescence כמותי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לכמת במדויק את ביטוי הסממנים הביולוגיים לאורך חתכים שלמים של רקמת סרטן אנושית, וזאת כדי להקצות ערך מספרי לדרגת ההטרוגניות בביטוי החלבון. דבר זה מושג תחילה על ידי סריקת חתכים של רקמת סרטן המסומנים באימונו-פלואורסצנציה באמצעות סורק פלואורסצנציה לשקופיות שלמות. לאחר מכן, נבחרים אזורי עניין בתוך הגידול לצורך הערכה.

לאחר מכן, הביטוי של החלבון הנבדק באזורי הגידול הפולשניים מכומת באמצעות מערכת ניתוח תמונות אוטומטית מסוג aqua analysis. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו למיפוי ביטוי של סמנים ביולוגיים ברקמת סרטן, שלעיתים קרובות היא מאוד הטרוגנית לאורך חיתוך הרקמה. היתרון המרכזי בשימוש בטכניקות אלו על פני שיטות מסורתיות, כגון אימונוהיסטוכימיה המשתמשת ברכיבי ויזואליזציה צבעוניים ומטריים, הוא שפלוורסצנציה עקיפה היא כמותית ורגישה יותר.

שילוב של שיטות אנליטיות אלו עם סריקת אימונופלואורסצנציה של נתח שלם מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של שינויים עדינים בביטוי של סמנים ביולוגיים ברחבי רקמות. לראשונה, הליכים אלו מודגמים על ידי Mark Gustafson, מנהל תפעול ישיר במעבדת Histo RX. לאחר חיתוך של ביופסיה מרקמת סרטן באמצעות מיקרוטום וצביעה אימונופלואורסצנטית של הדגימה לביטוי של הסמנים הביולוגיים הרלוונטיים, טענו עד חמש שקפיות של הנתחים הצבועים למגש השקפיות של סורק השקפיות.

לאחר מכן, השתמשו בממשק בקונסולת סורק המיקרוסקופ (scan scope console). עבור כל שקופית, בחרו אזור המקיף את כל הרקמה על השקופית, ללא קשר לתבנית הצביעה או להיבטים ניתנים לצפייה אחרים של הדגימה. לאחר מכן, באמצעות קונסולת סורק המיקרוסקופ, בחרו תחילה אזור רקמה להערכה, באופן אידיאלי בתוך אזור הגידול ברקמה, כדי לספק את הייצוג הטוב ביותר.

כעת, באמצעות תכונת החשיפה האוטומטית של קונסולת מיקרוסקופ הסריקה, קבעו את זמן החשיפה עבור כל ערוץ יחד עם מיקוד התמונה. השתמשו במעוין הכחול בתמונת קונסולת מיקרוסקופ הסריקה כדי לבחור אזור נוסף הרחוק מהרקמה, אך עדיין בתוך אזור השريחה שמתחת לזכוכית המכסה, כדי להגדיר את אזור הרקע שבו ייגזרו תמונות תיקון השטח השטוח (flat field correction). עבור כל מסנן, הוסיפו נקודות מיקוד לאזור הרקמה, המיוצגות על ידי ריבועים צהובים, כדי למטב את לכידת התמונה. אם נראה כי לתמונות יש רקע גבוה או ארטיפקטים אחרים, יש להזיז את אזור התמונה ולגזור תמונות חדשות.

לאחר מכן סורקים את הרקמה ואת תמונות הסליידים הדיגיטליים שהושגו מעלים באופן אוטומטי למסד הנתונים של Aperio spectrum. יש ללחוץ פעמיים על תמונת התמניאל בתוכנת spectrum כדי לבחור את הסלייד לניתוח מרשימת הסליידים הדיגיטליים במסד הנתונים של spectrum. לאחר מכן, באמצעות התמונה המלווה עם סימון h ו-D, סמנו את אזור העניין (ROI) בתמונה הפלואורסצנטית.

ניתן לבחור מספר אזורי עניין המוגדרים באמצעות עיגולים בודדים על מדגם אחד. התמונות עם ההערות נשמרות באופן אוטומטי למסד נתוני הספקטרום. כעת בחרו Analyze מסרגל התפריטים בחלק העליון של המסך; כאשר חלון הניתוח מופיע, בחרו histo RX aqua analysis מהתפריט הנפתח.

כאשר תהיו מוכנים להתחיל, לחצו על כפתור הניתוח (analyze). חלון קונסול מכווץ יופיע בשורת המשימות של Windows ויציג את התקדמות העברת התמונות ממאגר הנתונים של Spectrum למחשב המקומי. לאחר העברת הנתונים, תופעל תוכנת aqua analysis כדי להפיק aqua score באמצעות אלגוריתם דירוג aqua לא מפוקח, המבוסס על קיבוץ נתונים של סף דגימה ראשוני – אות תמונת ה-pan cytokeratin שמעל אות תמונת הרקע. דבר זה יאפשר שימוש בפיקסלים להגדרת מסיכת גידול (tumor mask), שבה ניתן יהיה להשתמש לחישובים המשכיים.

השתמשו בפיקסלים עם ביטוי גבוה של pan cytokeratin כדי להגדיר גם את האזורים הציטופלזמיים או הבלתי-גרעיניים של תאי הגידול. כפי שניתן לראות כאן, הפיקסלים עם אות גבוה בערוץ ה-DPI שנמצאים בתוך מסכת הגידול מזוהים כבעלי טבע גרעיני. אם במהלך הבדיקה מזוהים שדות שלא היו מתאימים לדירוג עקב ארטיפקטים של הדגימה או של הדמיון, שדות אלו יוחרגו מהדירוג ויביאו לתוצאה סופית של כישלון (fail).

תוצאות הדירוג של ה-aqua מוצגות כטבלה של ציונים המשויכים לכל אריח פיקסלים של 512 על 512 באזור העניין בתוך דגימת חתך רקמה שלמה, אותה ניתן לשמור ולהשתמש בה לצורך ניתוח סטטיסטי עוקב. מיקרוגרפיית תמונות אלו, הצבועות בהמטוקסילין ואאוזין, מדגימות כיצד אזורים שונים של אותו סרטן שחלה יכולים להפגין מורפולוגיה משתנה. התצפית בהגדלה גבוהה בצד ימין למעלה של איור B מדגישה תאים עם התבהרות ציטופלזמית ותבנית גדילה סולידית בחלקו העליון של הגידול.

עם זאת, לחלק התחתון של הרקמה המוגדלת בחלק הימני התחתון של איור C, יש ציטופלזמה אאוזינופילית הומוגנית יותר ותבנית צמיחה פפילרית. כאן, מפות חום של ההטרוגניות בביטוי ER בחתך רקמה של סרטן השחלה לפני ואחרי טיפול כימותרפית מוצגות בפאנלים העליון והתחתון בהתאמה. שימו לב לשינוי מביטוי ER משתנה ברחבי החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להפצה אחידה של ביטוי ER גבוה המסומנת באדום באיור התחתון.

הייצוג המספרי של שינוי זה מסומן משמאל על ידי הירידה במדד סימפסון (Simpsons index). באיור זה מוצגות שוב מפות חום של הטרוגניות של HER two בחתך רקמה של סרטן שחלה, לפני ואחרי טיפול, כפי שניתן לראות בפאנלים העליון והתחתון בהתאמה. שימו לב שוב לשינוי מביטוי HER two משתנה לאורך החתך, עם אזורים של ביטוי גבוה ונמוך באיור העליון, להתפלגות אחידה של ביטוי HER two גבוה באיור התחתון.

שוב ניתן לראות כי מדד סימפסון (Simpsons index) יורד. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שאיכות הנתונים המופקים מהניתוח המחשוב תלויה אך ורק באיכות הצביעה, אשר חייבת להיות ברמה טכנית גבוהה.