השוואה כמותית של Cis-רגולטוריות (Cre) אלמנט פעילות טראנסגנטי תסיסנית melanogaster
19 בדצמבר 2011
וריאציה פנוטיפי עבור תכונות יכול לנבוע מוטציות cis-הרגולציה (Cre) רצפים אלמנט השליטה דפוסי ביטוי גנים. שיטות נגזר לשימוש תסיסנית melanogaster יכול כמותית להשוות את רמות דפוסי במרחב ובזמן של ביטוי גנים בתיווך או שונה באופן טבעי וריאנטים cre.
המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד באופן כמותי את פעילויות הבקרה הגנטית של אלמנטים רגולטוריים מסוג CIS או CRE הפעילים במהלך ההתפתחות המטמורפית של drosophila melanogaster. התחל בשיטות אינטגרציה ספציפיות לאתר כדי להפיק שושלות שבהן ה-CREs מוטמעים טרנסגנית כטרנסגנים של דגמי דיווח (reporter transgenes). באמצעות מיקרוסקופ סטריאו, השג פרטים טרנסגניים בשלב ההתפתחותי המתאים.
הוציאו את הדגימות מהמקום החיצוני והעבירו אותן למשקוף זכוכית למיקרוסקופ. התמידו בתיעוד הרמה ותבנית הביטוי של חלבון הדגם הפלואורסצנטי בדגימות שלמות באמצעות אנליזה במיקרוסקופ קונפוקלי. לבסוף, כמתו את רמת הביטוי של חלבון הדגם הפלואורסצנטי עבור התמונות הקונפוקליות שתועדו באמצעות כלי התוכנה Image J.
תוצאות אלו מקצות רמה של פעילות בקרה גנטית כדי לסייע לאלמנט הבקרה ולהקל על מחקרי ביטוי גנים השוואתיים נוספים בגרסאות שונות של CRE. הליך זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח המעניינות חוקרים בתחום הבקרה הגנטית ואופן קידוד הבקרה הגנטית הזו. ה-DNA רלוונטי לביולוגיה התפתחותית ואבולוציונית.
נוהל זה פותח כדי לספק תובנות לגבי אלמנטים רגולטוריים של cis הפועלים במהלך ההתפתחות המטמורפית של drosophila melanogaster. עם זאת, באופן עקרוני, ניתן להחילוו על אלמנטים רגולטוריים של cis הפועלים במהלך שלבי התפתחות אחרים ובמינים אחרים של זבוב הפירות, או אפילו באורגניזמי מודל אחרים. כדי להרחיב את קווי התוצאה הטרנסגניים, הכינו שני מבחנות (vials) עם מספר זבובים זכרים ונקבות בימים חלופיים.
העבירו את הזבובים מאחד הבקבוקונים לבקבוкон חדש. חזרו על פעולה זו למשך שבוע. בסוף שבועיים, ודאו שזבובי הפירות הטרנסגניים נמצאים בשלבי התפתחות שונים, מהשלב הלרבלי ועד לשלב הבוגר.
התחילו במיון שלבי ההתפתחות של הדגימות בסוף שלב הלערבה השלישי (third instar), כאשר ה-ER כבר נוצר. שימו לב שהדגימה אינה ניידת. ה-ER רך ולבן והאלמנטים הכדוריים (sphericals) נסוגים; הגדירו נקודת זמן זו.
בנקודת הזמן 0 HAPF. הבדילו בין זכרים לנקבות על ידי נוכחותן של גונאדות הממוקמות באופן בילטרלי סביב מרכז הגוף, אשר נראות כעיגולים שקופים המשמשים לקביעת השלב ההתפתחי על בסיס אורך המטמורפוזה. בנקודת הזמן 0 HAPF, העבירו את הדגימות למבחנה נקייה באמצעות מכחול לח.
הוסיפו פיסת נייר Kim wipe והרטיבו במים כדי למנוע מהדגימות להתייבש. כעת, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 25 °C עד להגעה ל-HAPF הרצוי. לחלופין, ניתן למיין את הדגימות על בסיס זיהוי הנוכחות והמיקום של מספר סממנים מורפולוגיים, כפי שפירוטם מופיע בטקסט המלווה.
הדביקו בעזרת סרט הדבקה מעבדה פיסה של סרט אריזה ללוח ניתוח, כאשר הצד הדביק פונה כלפי מעלה. הרטיבו מברשת צבע והשתמשו בה כדי להחליק את הדגימות.
העבירו את הדגימות לסרט ההדבקה והדביקו אותן כאשר הגב פונה כלפי מעלה. הניחו לדגימות להתייבש במשך 15 דקות. פתחו בהדרגה את ה-ER באמצעות פינצטה.
התחילו מהקצה הקדמי או מה-perm והמשיכו לכיוון הקצה האחורי. לאחר מכן, העבירו את ה-pui לטיפה של שמן צמיגי על סמיכה של מיקרוסקופ ובחנו את הדגימה תחת המיקרוסקופ עבור דגימות של mount שלם. השתמשו בעדשה של Forex או בעדשה של 10x כדי להביא את הדגימה למיקוד.
באמצעות התוכנה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי, התאימו את אורך גל העירור עבור החלבון הפלואורסצנטי הרצוי כדי למנוע פוטובליצ'ינג (הבהרה פוטוכימית). התחילו עם עצימות לייזר של 5% עד 10%. אם האות חלש, הגבירו את העצימות לפי הצורך כדי לשפר את יחס האות לרעש. עבור תמונות קונפוקאליות, הפעילו בהגדרות התוכנה מיצע של מדידות פיקסלים מסריקות חוזרות, כגון kalman averaging, לצורך השוואות כמותיות של פעילות CRE בחתך C, שבו הפלואורסצנציה נראית העזה ביותר.
עברו לטבלת ביצועים (lookup table) של אזהרת רוויה וכוונו את הגבר (gain) וההיסט (offset) של מתח הערוץ להגדרות שבהן מספר מועט של פיקסלים נמצאים ברוויה. במידת הצורך, כוונו את מפתח המיקוד (confocal aperture). לאחר קביעת ההגדרות האופטימליות, בצעו סריקת ZS כדי להשיג סדרת תמונות לאורך ציר Z.
עם השלמת הסריקה, המיר את ערימת התמונות להיטל (projection) ושמור קובץ תמונה זה בפורמט TIF. לצורך השוואה כמותית של פעילויות CRE, השתמש באותן הגדרות מיקרוסקופ קונפוקאלי עבור כל הדגימות החוזרות וקווי הגנים של הגן המדווח (reporter transgene). עבור הניסוי, פתח תמונת TIFF להערכה לאחר הפעלת תוכנת Image J.
לחצו על כפתור הבחירה החופשית (freehand selection) ותחמו את אזור הדגימה שבו רצוי לבצע את הכימות. כדי לקבל נתון סטטיסטי של ערכי פיקסלים, לחצו על לשונית הניתוח (analyze) ולאחר מכן בחרו באפשרות מדידה (measure). רשמו את הציון הממוצע של ערכי הפיקסלים מתיבת התוצאות.
אסוף בנוסף ערך פיקסל ממוצע שני מאזור רקע שבו ה-CRE אינו פעיל. כדי להגיע לערך פיקסל ממוצע מתוקנן, המשך להפיק סטטיסטיקות של ערכי פיקסלים עבור דגימות חוזרות. לאחר מכן, מתוך ערכי הפיקסלים הממוצעים המתוקננים של החזרות, קבע את הפעילות הרגולטורית הממוצעת עבור A CRE וחשב גם את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע.
ניסוי זה משתמש בעוצמת הפנוטיפ של הצלת העין הלבנה כדי להפוך קווים טרנסגניים להומוזיגוטים. רקע גנטי של מוטציה בגן white עם רצף אתר נחיתה A TTP משמש לאינטגרציה ספציפית של טרנסגן לאתר. פרטים טרנסגניים, המיזיגוטים והומוזיגוטים לווקטור המשולב, נבחנים על פי עוצמת פנוטיפ צבע העין המנושל, בהתאם למספר העותקים של גן ה-mini white המשולב.
לאחר מכן מקריבים קווים הומוזיגוטים על ידי הכלאה של זבובים זכרים ונקבות בעלי הפנוטיפ של צבע העין הכהה ביותר. סמנים מורפולוגיים משמשים לקביעת שלב הגלגול של הדרוזופיליה במהלך הגלגול מפשעת לזבוב פירות בוגר. הפרט עובר סדרה של מורפולוגיות סטריאוטיפיות שניתן להשתמש בהן כדי לקבוע את המין ולהעריך את שלב ההתפתחות. כאן.
גרסה של סוג בר (wild type) של אלמנט בקרה (CRE), המכונה האלמנט הדימורפי, מניעה רמות גבוהות של ביטוי של חלבון הדווח EGFP במקטע הבטני של ה-ASIC בנקבות זבוב הפירות. רצף של 13 זוגות בסיסים בתוך CRE זה נמצא כאתר קישור עבור גורם השעתוק DSX, והחשיבות של רצף זה במצב in vivo הודגמה על ידי כימות הפעילות הרגולטורית של ה-CRE כאשר אתר קישור זה מוטג. ניתוחים כמותיים מצביעים על כך שהמוטציה באתר DSX זה הפחיתה את הפעילות הרגולטורית ל-28 פלוס או מינוס 3% מהביטוי של סוג הבר, בהקשר של אתר השבחה של הגן המעובּר (transgene) שנעשה בו שימוש כאן.
השוואות דומות מעריכות פעילויות רגולטוריות עבור אללים של CRE תוך-מיניים או בין CREs אוטולוגיים ממינים נפרדים, לדוגמה, בהשוואה לרמות של EGFP במקטע הנשי. CREs אוטולוגיים עבור המינים D stimulants ו-D willi, המונעים על ידי זן D Melin gastric Canin S, בעלי פעילויות רגולטוריות השוואות ל-75% פלוס או מינוס 4% ואפס% פלוס או מינוס 0%, בהתאמה. ניתן להשתמש בשיטות פרוצדורליות עוקבות, כגון השתקה של RNA (RNA interference), עם גנים של גורמי שעתוק כדי לענות על שאלות נוספות לגבי האופן שבו גנים אלה של גורמי שעתוק מקיימים אינטראקציה עם אלמנטים רגולטורים של CYS.
דבר זה יבוא לידי ביטוי בעלייה ובירידה של ביטוי חלבון רהפורטר פלואורסצנטי המונחים על ידי אלמנטים רגולטוריים מסוג CIS לאחר פיתוחם. הליך זה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הבקרה הגנטית לבחון את החשיבות התפקודית של מוטיבים באלמנטים רגולטוריים מסוג cis ושל מוטציות שהתפתחו על ביטוי גנים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד במדידה כמותית של פעילויות ויסות גנים של אלמנטים רגולטוריים מסוג cis (CREs) במהלך ההתפתחות המטמורפית של Drosophila melanogaster. השיטות כוללות יצירת קווים טרנסגניים עם טרנסגנים של דגמי דיווח (reporter transgenes) לצורך ניתוח דפוסי ביטוי גנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- גנטיקה
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- אלמנטים לוויסות סיס (Cis-regulatory elements - CREs) ממלאים תפקיד מכריע בביטוי גנים.
- שונות פנוטיפית יכולה לנבוע ממוטציות ברצפי CRE.
- Drosophila melanogaster משמשת כאורגניזם מודל לחקר ויסות גנים.
- הבנת CREs יכולה לספק תובנות לגבי תהליכי התפתחות.
מטרת המחקר
- להערכה כמותית של פעילויות הבקרה הגנטית של CREs.
- להשוואה בין דפוסי ביטוי גנטי מרחביים וזמניים.
- לשימוש בווריאנטים של CRE, הן מושגים באופן טבעי והן כאלו שעברו שינוי, לצורך ניתוח.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- שיטות אינטגרציה ספציפיות לאתר ליצירת קווים טרנסגניים.
- שימוש במיקרוסקופ סטריאוסקופי להשגת דגימות בשלב ההתפתחותי הנכון.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לתיעוד ביטוי של חלבוני דגל פלורסצנטיים.
- כימות רמות הביטוי באמצעות תוכנת ImageJ.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של שורות Drosophila טרנסגניות עם טרנסגנים של רפורטר.
- השגת נתונים כמותיים על דפוסי ביטוי גנים.
- תובנות לגבי הפעילות הרגולטורית של וריאנטים ספציפיים של CRE.
- הדגמת יעילותה של המתודולוגיה בחקר רגולציית גנים.
מסקנות
- המחקר מספק מסגרת לניתוח פעילויות של CRE ב-Drosophila.
- הממצאים תורמים להבנת הבקרה על ביטוי גנים במהלך ההתפתחות.
- ניתן להחיל את המתודולוגיה על מחקרים גנטיים אחרים העוסקים ב-CREs.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של פעילות אלמנטים לוויסות סיס (CRE) ב-Drosophila טרנסגנית מאפשרת בחינה מדויקת של הלוגיקה של ויסות גנים, ובכך תומכת בגילוי מוקדם ובתיקוף מטרות במחקר גנטי והתפתחותי. גישה זו מגבירה את הביטחון החיזויי בגנומיקה פונקציונלית על ידי מתן אפשרות למדידה ישירה של השפעות רצפי ויסות, ובכך מקלה על קבלת החלטות מותאמות סיכון בנקודות מפנה מרכזיות בשרשרת הגילוי. יכולת ההסתגלות של השיטה לשלבי התפתחות שונים ולאורגניזמי מודל ממצבת אותה ככלי רב-שימושי עבור מחקר ופיתוח בקנה מידה ארגוני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה כמותית של תפקוד אלמנטים רגולטוריים (CRE) והלוגיקה הרגולטורית שלהם in vivo.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי מדידת ההשפעה של מוטציות ספציפיות או וריאנטים של רצפים.
- מקל על ניתוח השוואתי של CREs אורתולוגיים או אלליים כדי להבהיר שימור תפקודי או התבדרות.
- מספק ראיות ישירות לתיקוף מטרות (target validation) באמצעות תוצרי ביטוי גנים מדידים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מבסס תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים לשחזור עבור בדיקות רפורטר מונעות-CRE באמצעות אינטגרציה ספציפית לאתר.
- מספק תוצאות כמותיות מבוססות-תמונה המתאימות לסריקות המשך או למחקרים השוואתיים.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה (scalability) ושימוש חוזר בפלטפורמה עבור CREs שונים, שלבי התפתחות או מינים שונים.
- תומך בהערכה מהימנה של הפרעות גנטיות או השפעות של תרכובות על פעילות רגולטורית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים את התפקוד של רצפים רגולטוריים לתוצאות פנוטיפיות הרלוונטיות למודלים של מחלות או לווריאציות של תכונות.
- מספק רצף מניתוח רגולטורי בשלב הגילוי ועד לתיקוף במודלים פרה-קליניים.
- מאפשר קידום מותאם-סיכון באמצעות כימות ההשפעה התפקודית של מוטציות רגולטוריות.
- תומך בפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי קישור פעילות של CRE לפנוטיפים נצפים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ראשונית דרך זיהוי מובילים ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך היא תומכת במטרות מחקר מכניסטיות וטרנסלציונליות כאחד.
- ביולוגיה של הגילוי: ניתוח כמיותי של CRE מבהיר מנגנוני בקרה גנטית ומפחית סיכונים בבחירת המטרה.
- סריקה: בדיקות רפורטר סטנדרטיות מאפשרות השוואה כמותית הניתנת לשחזור של וריאנטים רגולטוריים.
- אנליטיקה: כימות פלואורסצנציה מבוסס תמונה מספק פלטי סטטיסטיים חסונים להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: הערכה פונקציונלית של CRE מסייעת להתאמת סמנים ביולוגיים ולפיתוח מודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: זרימת העבודה ניתנת להתאמה על פני רקעים גנטיים, שלבי התפתחות ואורגניזמי מודל שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי ויסות גנים.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות כמותיות סטנדרטיות, ניתנות להרחבה וניתנות לשחזור עבור תפקוד של אלמנטים רגולטוריים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי אפשור ולידציה פונקציונלית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מטרות גנטיות ווריאנטים רגולטוריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות ביצירת מודלים טרנסגניים ובניתוח דימות קונפוקאלי.
- תלוי בגישה למערכות אינטגרציה ספציפיות לאתר ולתשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הדימות והכימות לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לשלבי התפתחות, מינים ורצפי בקרה שונים באמצעות התאמות בפרוטוקול.
- תוצרים כמותיים מותנים בהגדרות דימות עקביות ובניתוח סטטיסטי לאורך החזרות.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:34
Obtaining and Staging Metamorphic Flies
2:49
Steps to Remove Specimen from Puparium
3:33
Confocal Microscopic Evaluation of Reporter Gene Expression in a Whole Mount Sample
4:49
Quantifying cis-Regulatory Element Activity with ImageJ
5:34
Utility of Quantitative CRE Activity
7:34
Conclusion
