ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

בסרטון זה, פעילות של קינאז ופוספטאז מנוטרת לאורך מחזור התא באמצעות העברת אנרגיה בתהודה של פורסטר, או FRET. כאן, גשש לפעילות של Polo-like kinase 1 או PLK1 כולל חלבון פלואורסצנטי כחול CFP בקצה אחד וחלבון פלואורסצנטי צהוב YFP בקצה השני. גשש זה מותמר לתוך תאי U2 OS.

כדי לבחון את מצב הפוספורילציה של יעדי LK במהלך המעבר בין G2 ל-M, תאי U2 OS שעברו טרנספקציה מועברים לדימיג' פלואורסצנציה בשיטת time lapse. כאשר CFP ו-YFP נמצאים בקרבה רבה ו-CFP מעורר, אנרגיה מועברת ל-YFP וניתן לזהות פליטה של YFP. עם זאת, כאשר הגשוש הופך למפוספוריל, שינוי קונפורמציוני בחלבון מפריד בין CFP ל-YFP.

כעת, כאשר CFP מעורר, מזוהים פליטת CFP חזקה ופליטת YFP חלשה בלבד; כימות של יחס פליטת YFP לאחר עירור של CFP ו-YFP מדגים כי פעילות PLK 1 עולה בשלב G2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה. לפיכך, היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צילום גיאומטרי סטנדרטי, הוא ההקפדה על כך שסבב התא אינו מופר, הן על ידי תנאי הצילום והן על ידי ביטוי של הגשוש. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום סבב התא, כגון היכן ומתי קינזות או פוספטאזים ספציפיים מופעלים.

אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי אנזימים המווסתים את מחזור התא, ניתן ליישמה גם במערכות אחרים הדורשות תנאי סנכרון (unres), כגון בדיקות פרוליפרציה של תאים. כדי לנטר את מחזור התא האנושי, תאי U2 OS עוברים טרנספקציה עם גשש פעילות של PK1 המבוסס על FRET. באמצעות שיטת טרנספקציה סטנדרטית של סידן-פוספט, התאים נבחרים ב-puromycin למשך שבעה ימים לפחות.

שלב זה מעשיר את אוכלוסיית התאים המבטאים את הגשש ומגביל את מספר התאים בעלי רמות ביטוי רעילות או רמות ביטוי המשפיעות קשות על מחזור התא. לאחר מכן נבחרים שיבוטים יציבים באמצעות דילול מוגבל לבדיקת ביטוי של CFP, ולאחר מכן נבחן ביטוי של YFP כדי לוודא שהם נוכחים בכל התאים ביחס דומה בקירוב. אם חלק מהתאים מכילים רק CFP או YFP, סביר להניח שהתרחש רקומבינציה; במקרה זה, יש לחזור על הכנת הפלסמיד תוך שימוש בחיידקים הפחות נוטים לרקומבינציה הומולוגית, כגון תאי sure 2, ולאחר מכן לבצע ליניאריזציה לפלסמיד ולחזור על התעתוק.

לאחר שהתאים מביעים את הגשש באופן יציב, זרע אותם בצלחות עם תחתית זכוכית בעובי 1.5 לאחר שהם נצמדו והגיעו ל-30 עד 50% התמזגות (confluency). החלף את המצע למצע שאינו תלוי CO2 ואינו מכיל פנול אדום, והנח את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיגנטי ממוטור מתוך הגדרה של בקרת טמפרטורה ל-37 °C. המיקרוסקופ צריך להיות מצויד במסנני עירור ופליטה עבור CFP ו-YFP.

מראת ROIC המתאימה לניטור CFP ו-YFP ועדשה המתאימה לרזולוציה הנדרשת. במקרה זה, נעשה שימוש בעדשת אוויר 20 x NA 0.75. בעזרת אור תבנית (transmitted light), הגבירו את התאים למיקוד.

אין להשתמש בתאורה פלואורסצנטית בשלב זה, כיוון שהיא תגרום לתגובת מאמץ שעלולה להפריע למחזור התא. כדי למנוע פוטו-טוקסיות, הגדירו את הכיפוף למקסימום הזמין המאפשר את הרזולוציה התת-תאית הנדרשת. בניסוי זה, צריכה להיות אפשרות להבחין בין הגרעין לבין הציטופלזמה.

הגדירו זמן חשיפה קצר והכניסו מסנן צפיפות ניטרלית גבוהה. לאחר מכן, רכשו תמונת מבחן של 12 או 16 ביט באמצעות עירור ופליטה של YFP; התאימו את זמן החשיפה ואת מסנני הצפיפות הניטרלית כך שהעוצמה הממוצעת בתא תהיה שווה בקירוב לעוצמת הרקע בתוספת פי חמישה מההפרש בין עוצמת הרקע המינימלית למקסימלית. כדי לוודא שהתמונות אינן רוויות, בחנו את עוצמת הפלואורסצנציה עבור תמונת הדגימה.

העוצמה המקסימלית בתמונה צריכה להיות פחות ממחצית מהטווח הדינמי כדי לאפשר הבדלי עוצמה כאשר תאים נכנסים למיטוזה. לאחר מכן, חזור על תהליך זה תוך שימוש במסנני עירור CFP ופליטה YFP. בחר מספר אזורים עם תאים שעברו טרנספקציה, למעט האזורים ששימשו למיקוד ולאופטימיזציה של תנאי החשיפה.

כיוון שייתכן שהליכים אלה עוררו תגובת סטרס, ודאו שהעוצמה המקסימלית נמוכה ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים. הגדירו בתוכנה לרכוש שתי תמונות בכל 45 דקות באמצעות עירור YFP, פליטת YFP ועירור CFP. מסנני פליטת YFP.

כמו כן, הגדירו את האורך הכולל של הניסוי כך שיעלה על משך מחזור התא. לאחר שהכל הוגדר, התחילו ברכישת תמונות; לאחר השלמת הרכישה, פתחו את התמונות שנרכשו ועקבו אחר זמן מחזור התא ממיטוזה אחת למיטוזה הבאה. עבור תאים המבטאים כאן את הגשוש (probe) שהועבר בטרנספקציה, זמן מחזור התא היה בערך 20 עד 25 שעות.

השוו זאת לנתוני הבקרה עבור סוג התאים שנעשה בו שימוש. אם זמן מחזור התא תואם לתזמון הייחוס, ניתן לנתח את ה-fret. לאחר אימות התזמון, ניתן לנתח את התמונות.

ניתן לבצע את הניתוח באמצעות רוב התוכנות המוקדשות למיקרוסקופיה. כאן נעשה שימוש בתוכנה החינמית ImageJ עם התוסף Ratio Plus. התחילו את הניתוח על ידי פתיחת התמונות ב-ImageJ. אם התמונות הן בפורמט של ערימה רב-צבעית (multicolor stack), הפרדו את הערוצים הבודדים על ידי המרתם ל-hyperstack באמצעות בחירת התמונה.

לאחר מכן, בצעו Hyperstack ואז Stack to Hyperstack. ייפתח חלון ההמרה ל-Hyperstack עם ההגדרות המוצגות; לחצו על OK. התמונה תוצג כעת עם שני סרגלי הזזה מתחתיה.

כדי לפצל את התמונות למערכי ערוץ בודד, לחצו על תמונה ובחרו ב-hyper stack reduce dimensionality. פעולה זו תפתח את חלון ה-reduce; ודאו כי frames ו-keep source בחורים. לאחר מכן לחצו על Okay.

תמונה חדשה המכילה ערוץ אחד בלבד תופיע. חזרו על תהליך זה כדי להציג תמונה חדשה עם הערוץ השני. לאחר מכן, כדי להגביר את הבהירות הוויזואלית של התמונות הסופיות, בחרו את ה-YFP excitation YFP emission stack.

לחצו על process, ולאחר מכן לחצו על math. לאחר מכן בחרו ב-multiply. כאשר ייפתח חלון ה-multiply, הזינו את המספר שלוש כדי להכפיל את ה-YFP excitation YFP emission stack ב-3. שלב זה הוא רשות ומבטיח שהיחסים לא יהיו בטווח שבין אפס לאחד.

בשלב הבא, בסרגל הכלים של ImageJ, בחרו בכלי השרטוט החופשי (freehand tool). לאחר מכן, בערימה של עירור YFP ופליטת YFP, שרטטו אזור עניין (ROI) באזור נטול תאים, אך הקרוב לתא שיימדד. כדי להוסיף את ה-ROI למנהל ה-ROI, לחצו על analyze tools ואז על ROI manager.

חלון מנהל ה-ROI יופיע. לחצו על add כדי לשמור את קואורדינאטות ה-ROI לצורך מדידת העוצמה הממוצעת של ה-ROI בערימת YFP excitation YFP emission. לחצו על analyze, ולאחר מכן בחרו ב-measure.

חלון התוצאות ייפתח. בחרו את ערימת התמונות של עירור CFP ופליטת YFP. לאחר מכן, לחצו פעמיים על ה-ROI במנהל ה-ROI ובצעו את המדידה שוב.

המדידה מתווספת לחלון התוצאות. גללו למיקומים אחרים בערימה כדי לחזור על תהליך זה בנקודות זמן מרובות. ודאו שעוצמות הרקע הסמוכות לתא המבוקש דומות לאורך כל הסרט על ידי השוואת המדידות בחלון התוצאות.

כדי להגדיר מדידות הכוללות עוצמה מינימלית, לחצו על analyze, ולאחר מכן לחצו על set measurements וציינו את ערכי האפור המינימליים והמקסימליים. לאחר מכן יופיע חלון המציג חלופות מדידה. לאחר התאמת הבהירות והניגודיות לפי הצורך, שרטטו ROI המכסה את רוב התא ומדדו את העוצמה המינימלית בשתי הערימות (stacks).

לאחר מכן, בצעו מדידות כפי שנעשה בעבר, אך הפעם השתמשו בתא במקום ברקע. באמצעות הערכים מסעיפי התוצאות, חשבו את ההפרש בין העוצמה המינימלית שנמדדה לבין עוצמת הרקע וחלקו בשניים. פעולה זו מספקת הערכה ראשונית לערך קיטוע (clipping value) עבור יחס פתיחה בתוספים נבחרים.

לאחר מכן, בחרו ב-ratio plus. עבור יחס FRET, בחרו ב-CFP excitation YFP emission S stack one, או עבור ויזואליזציה של יחס FRET הפוך, כאשר יעילות ה-FRET פוחתה בעקבות פוספורילציה, בחרו ב-YFP excitation YFP emission S stack one כדי להזין את עוצמות הרקע הנמדדות וערכי ה-clipping.

השתמשו בערכים מחלון התוצאות והדביקו אותם בחלון ה-ratio plus. הגדירו את קנה המידה (scaling) של ערימת היחסים (ratio stack) שהתקבלה והחילו לוח חיפוש (lookup table) מתאים כדי להמחיש ויזואלית את השינויים ביחס. תאי U2 OS המבטאים גשש מבוסס FRET למעקב אחר פעילות PLK1 צולמו למשך 60 שעות כפי שמתואר בסרטון זה.

תמונה זו מציגה כניסה מצטברת למטקירה של 50 תאים המבטאים גשש FRET, כולל חלוקות של תאי בת. מרבית התאים המבטאים את הגשש מתרבים עם זמן מחזור תא שבין 20 ל-25 שעות, מה שמעיד כי תנאי הדמיה ורמות הביטוי של הגשש אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. ייצוג בצבעים מלאכותיים של יחס FRET הפוך, העוקב אחר תא אחד לאורך ארבע חלוקות, מדגים כי למרות רעש ניכר, נראה מגמה שבה פעילות PK1 עולה ב-G2 ומגיעה לשיאה במהלך המיטוזה.

כאשר הנתונים הגולמיים עוברים סינון ממוצע ומוצגים כגרף, קל להעריך את הזמן בין שיאי הפעילות. איור זה מציג כימות של יחס ה-fret ההפוך של התא שהוצג בתמונות הקודמות מתוך הגרף. ניתן להעריך את עיתוי ההפעלה, וכפי שניתן לראות כאן, הפספורילציה של הגשוש הופכת נראית כארבע שעות לפני שהפספורילציה מגיעה לשיאה במитоזה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על התאים במצב שאינו תחת עקה (stress), ולכן יש להמעיט בחשיפה לאור ולמזער שינויים בטמפרטורה או ב-pH. חשוב לזכור ששיטה זו מנטרת את האיזון בין פעילות הקינאז (kinase) לפעילות הפוספטאז (phosphatase) בתא. ניתן לשלב פרוצדורה זו עם הפרעה של RNA (RNA interference) או עם סריקות של מעכבים (inhibitors) כדי לזהות את הרגולטורים שמעלה (upstream regulators) של קינאזים ופוספטאזים אלו.