שיטות גילוי הקרינה לפלטפורמות אגל microfluidic
10 בדצמבר 2011
Droplet מבוססי פלטפורמות microfluidic הם המועמדים המבטיחים לניסויים תפוקה גבוהה שכן הם מסוגלים להפיק, picoliter עצמית מידור כלי ובזול בשיעורים קילוהרץ. באמצעות שילוב עם מהירות, רגישות גבוהה שיטות ספקטרוסקופיות ברזולוציה פלואורסצנטי, כמויות גדולות של מידע שנוצר בתוך מערכות אלה ניתן לחלץ ביעילות, לרתום ולנצל אותו.
שלום, אני ג'רסי. היי, שמי שאבי ושנינו חוקרי פוסט-דוקטורט ב-Imperial College of London, העובדים עם פרופסור Andrew Di Melo וד"ר Josh Del בפלטפורמות טיפות מיקרופלואידיות. פלטפורמות מיקרופלואידיות מבוססות טיפות הן מועמדות מבטיחות לניסויים בתפוקה גבוהה יותר, מכיוון שניתן להפיקן בנפחים גבוהים מאוד ומוגדרים במדויק, ובתנאים מסוימים, תדירות ההפקה יכולה להגיע למספר אלפי טיפות לשנייה.
יתרה מכך, מכיוון שניתן לכלוש את אזור העניין במדורים קטנים עד כדי סדר גודל של פסיקו-ליטרים, ניתן לבטל הן את הדיבוב (crosstalk) והן את הדיספרסיה, ולתזמן תהליכים אנליטיים בדיוק רב יותר. בקבוצה שלנו, כבר יישמנו בהצלחה פלטפורמות של מיקרו-טיפות למגוון רחב של יישומים. לדוגמה, תגובת שרשרת פולימראז (PCR), סינתזה של ננו-חלקיקים ובדיקת תא ברמה מולקולרית בודדת.
יש לחלץ, לרתום ולנצל ביעילות את כמויות המידע הגדולות הנוצרות בתוך מערכות אלו. בהקשר זה, שיטת הגילוי המועדפת צריכה להיות מתאימה, לספק רגישות גבוהה וספי סף נמוכים לגילוי, להיות ישימה למגוון של מינים מולקולריים, להיות לא הרסנית, ולהיות ניתנת לשילוב עם התקני מיקרופלואידיקה באופן פשוט.
בפרוטוקול זה, נציג שתי שיטות המיושמות לזיהוי תאים בודדים ולמיפוי תהליכי ערבוב ב-Dropbox. שבבים מיקרופלואידיים מיוצרים באופן מסורתי ב-poly dimethyl Sloane PGMS באמצעות שיטות פוטוליתוגרפיה. תהליך זה צריך להתבצע במתקן חדר נקי כדי להשיג ערוצים מיקרופלואידיים: Spinco, SU eight 50 על פרוסת סיליקון, אפייה רכה (soft bake) על פלטה חמה ב-65 degrees וב-95 degrees כדי לאדות את הממס ולדחוס את הסרט; לאחר קירור, חשיף את ה-SU eight, resist באמצעות קרינת UV תחת המסכה המתאימה, ולאחר מכן אפה את הפרוסה ב-65 degrees וב-95 degrees לאחר קירור.
פתח את האזורים שאינם חשופים באמצעות תמיסת הפיתוח המתאימה תוך כדי ערבוב. השתמש בממס EC טרי כדי לשטוף את הפרוסה ולאחר מכן ייבש אותה תחת זרם גז ליצירת משטח נקי. טפל בפרוסה באמצעות שטיפות של hexane ו-methanol.
כדי להשלים את תהליך ייצור התבנית הראשית, יש לאייד סוכן קיבוע על פני השטח בתוך דסיקטור למשך 40 דקות. ליצירת מצעים מיקרופלואידיים מובנים, מערבבים S guard 1 8 4 ביחס של 10 ל-1 של שרף ומקשר (crosslinker), ויוצקים זאת על התבנית. יש לבצע ניקוך אוויר (degas) בתוך דסיקטור ולהקשיות את ההתקן בטמפרטורה של 65 °C.
חתכו את ה-PDMS שהתגבש וקלפו אותו מהתבנית (master). צרו חורי גישה עבור צינוריות נוזלים באמצעות מחץ ביופסיה (biopsy punch). הגבישו שכבה נוספת של PDMS למשך 20 דקות ב-65 degrees.
הניחו את השכבה העליונה שהוכנה על השכבה התחתונה והקשיה למשך לילה בטמפרטורה של 65 °C. קלפו את השבבים מתוך צלחת הפטרי וחתכו אותם לקוביות. לאחר ייצור השבבים, הם מוכנים לשימוש על ידי הזרמת התמיסות הרלוונטיות.
מלאו את המזרקים בתמיסות הדרושות, תוך וידוא שלא נותרו בועות אוויר באף אחד מחלקי הצנרת. להפקת טיפות משתמשים בשני פאזות. הפאזה המימית המפוזרת מכילה את הריאגנטים הרלוונטיים.
הפאזה השמנית משמשת כפאזה הרציפה; חבר צינורית בעלת קוטר פנימי זהה לזה של קצות מחטי המזרקים לקצוות המחטים, התקן את המזרקים על משאבת מזרקים והגדר את קצב הזרימה הרצוי להזרקה. עבור כל פאזה, מומלץ להשתמש ביחס מינימלי של 1 בין קצבי הזרימה של השמן למים כדי למנוע הרטבה של ה-PDMS על ידי הפאזה המימית, אשר תוביל ליצירת טיפות לא יציבה. חבר את הקצוות השניים של הצינוריות ישירות לחורים שננקבו במצע ה-PDMS.
עבור תמיסות מורכבות יותר, ניתן להשתמש גם בסיליקה, בפתחי קפילרות או במחברים. חברו את פתח היציאה של השבב לצינורית והפנו אותו אל אספן לאיסוף פסולת או לעיבוד לצורך ניתוח נוסף. לאחר הגדרה זו, קיימות שתי תצורות עיקריות של מיקרו-תעלות ליצירת טיפות: מיקוד זרימה (flow focusing) או פורמט של צומת T, כתוצאה מכוחות הגזירה הנוצרים משימוש בגיאומטריות אלו כדי להביא את שני הנוזלים המותרים למגע, ומהכוחות הקפילריים שמתפתחים בממשק ביניהם.
טיפות בודדות ומפוזרות, קטנות עד לרמה של פemtolieters בודדים, נוצרות באופן ספונטני. ברגע שהטיפות נוצרות, ניתן לבחון אותן באמצעות מערך אופטי. המערכת האופטית מוקמת לפי הפרוטוקול הבא.
השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי בעל יכולת מיקום סוב-מיקרונית אוטומטית ובלייזר הפועל באורך גל התואם את הבליעה של הפלואורופורים המעורבים. כדי לעורר אותם, השתמש בלייזר פולסים הפועל בקצבי חזרה של מספרים של מגה-הרץ לצורך דימות זמן חיים פלואורסצנטי. בניסויי ליחה משתמשים במראות להכוונת קרן ואופטיקה כדי לשלוט בגובה הקרן ובכיוון הקרן.
השתמש במראה דיכרואית כדי להחזיר את קרן הלייזר אל תוך עדשת העדשה. אם נעשה שימוש בשני לייזרים בו-זמנית, ניתן להתקין מראה דיכרואית רב-פסית (dual band). כדי לאפשר החזרה של שתי קרני הלייזר, השתמש בעדשת מיקרוסקופ בעלת NA גבוהה עם תיקון אינסוף כדי להביא את אור הלייזר למיקוד הדוק בתוך תעלה מיקרופלואידית.
אסוף את הפלואורסצנציה הנפלטת מהדגימה בתוך התעלה המיקרופלואידית, תוך שימוש באותה עדשה עם NA גבוהה והעברה דרך אותה מראה דיכרואית. הסר כל שארית של אור עירור באמצעות מסנן פליטה ברוחב פס יחיד או כפול. מקד את פליטת הפלואורסצנציה אל תוך חור סיכה (pinhole) של 75 micrometer.
תוך שימוש בעדשה קמורה-מישורה. מקמו את חור הסיכה (pinhole) במישור הקונפוקאלי של עדשת המיקרוסקופ. השתמשו במראה דיכרואית נוספת כדי לפצל את האות הפלואורסצנטי לשני גלאים.
סננו את הפלואורסצנציה המוחזרת מהמראה הדיכרואית באמצעות מסנן פליטה, ומקדו אותה בעזרת עדשה קמורה-שטוחה (plano convex) אל הגלאי הראשון. עבור ניסויים הכוללים פלואורפור אדום משני, סננו את הפלואורסצנציה המועברת דרך המראה הדיכרואית באמצעות מסנן פליטה נוסף, ולאחר מכן מקדו אותה בעזרת עדשה קמורה-שטוחה נוספת אל הגלאי השני. השתמשו בדיודות פוטו-מפולת (avalanche photo diodes) לגילוי פוטוני פלואורסצנציה.
עבור רכישת נתוני פלואורסצנציה, חברו את האות האלקטרוני מגלאי ה-avalanche photo diode למכשיר DAQ רב-תכליתי לרישום נתונים הפועל על מחשב אישי. עבור ניסויי ליחה, השתמשו בלייזר פולס וחברו את הגלאים לכרטיס TCS PC של ספירה של פוטון בודד במתאם זמן (time correlated single photon counting) הפועל על מחשב נפרד. כרטיס זה מאפשר השגת נתוני זמן חיים של פלואורסצנציה.
בשימוש במתודולוגיית TCS PC. כל פוטון פלואורסצנטי שזוהה מקושר לפולס לייזר פוגע, ולכן לכל פוטון פלואורסצנטי שנפלט משויך זמן השהיה. ניתן להתאימה נתונים אלה לעקומת דעיכה אקספוננציאלית בודדת או מרובה כדי לקבל הערכה של קצב הקרינה של הפלואורופורים.
כיום אנו יודעים שתאים הם הטרוגניים מאוד הן מההיבט הביולוגי, הפיזי והכימי. לכן, באופן אידיאלי, עלינו לנתח כל תא בנפרד. עם זאת, יש לבצע את הבדיקות בתפוקה גבוהה יותר כדי שנוכל לאסוף מספיק מידע כמותי להגעה למסקנה מהימנה ומשמעותית.
כאן מוצגת דוגמה לכלילה של תאי e coli בטיפה בודדת, כדי להדגים כיצד ניתן לבצע זאת. השתמשו בזן e coli top 10 שגודל במהלך הלילה. כדי לזהות את חיוניות התאים, השתמשו ב-cyto nine וב-propidium iodide.
שני הצבעים הם צבעים שמשתלבים ב-DNA ועוצמת הפלואורסצנציה שלהם עולה פי 20 ומעלה. בעת קישור ל-DNA, cyto nine הוא צבע פלואורסצנטי ירוק החודר דרך ממברנה, ואילו propidium iodide הוא צבע פלואורסצנטי אדום שאינו חודר דרך ממברנה.
כך תאים חיים פולטים פלואורסצנציה ירוקה, בעוד שתאים מתים מראים פליטות הן בירוק והן באדום. כאן ניתן לראות יצירת טיפות וכליאה של תא בודד באמצעות צומת T. סרטון זה הוקלט במצלמה במהירות גבוהה, אך ניתן לייצר טיפות בקצב של אלפים לשנייה.
בעת כיסוי תאים (encapsulating), יש לוודא שתרבית התאים מדוללת כך שמספר התאים יהיה קטן ממספר הטיפות הנוצרות, ושמנעו מהתאים לשקוע, דבר שעלול להתרחש במזרק או בצינוריות. השתמשו במגנט ערבוב בתוך המזרק כדי לשמור על פיזור אחיד של התאים בתמיסה. השתמשו בצינוריות דקות מאוד, 50 micrometers, לחיבור המזרק למיקרוצ'יפ.
פעולה זו מבטיחה קצב זרימה מהיר בתוך הצינור ובכך מונעת מהתאים לשקוע. להלן דוגמאות טיפוסיות של ספירת פוטונים כפונקציה של זמן עבור הניסויים המבוססים על תאים. למיפוי תהליכי ערבוב בתוך טיפות.
ניתן להפיק טיפות באמצעות שני פלואורופורים שונים בעלי זמני חיים שונים. בתוך טיפה זורמת נוצר שדה זרימה, אשר בסופו של דבר מערבב את שני התמיסות שהיו מופרדות במקור כדי להגביר את תהליך הערבוב. ניתן לשנות את הסימטריה של שדה הזרימה באמצעות שימוש בתעלות מפותלות.
על מנת לבחון את הטיפות, מקדמים את נפח הגילוי האופטי למחצית מגובהו של מיקרו-ערוץ שבו זורמות טיפות; מתחילים מצד אחד של הערוץ ומבצעים כל ניסוי לאורך כל רוחב הערוץ, במרווחים של 1 µm. יש ליישם אלגוריתם להבחנה בין פולסים בודדים הקשורים לטיפות לבין רעש הרקע של פאזת השמן, ולקביעת משכו של כל פולס.
יש ליישם אלגוריתם שני כדי לחלץ את ערכי זמן העיכוב והעוצמה לאורך כל טיפה ברוחב הספציפי שבו בוצע הניסוי. לאחר מכן, יש להשתמש באלגוריתם של אומד נראות מקסימלית (MLE) כדי להעריך את זמן חיים של הפלואורסצנציה של כל טיפה בניסוי. חישוב ממוצע של ערכי זמן החיים עבור כל הטיפות בניסוי מפחית את השגיאה הסופית של חישוב ה-MLE.
ככל שייבדקו יותר טיפות, כך תקטן השגיאה לאחר השגתו של מסלול זמן חיים. עבור כל רוחב, שלבו את כל המסלולים במפה דו-ממדית. מכיוון שכל ערך של זמן חיים מקושר לתערובת מסוימת של שני הפלואורים, ניתן להפיק כך מפת ריכוזים או מפת ערבוב.
תיארנו את הייצור של התקן מיקרו, את מערך הניסוי ואת הפרוטוקולים הנלווים ליצירת מיקרו-טיפות, לכיס אותן בתוך אזור מוגדר ולגילוי אופטי של התהליך ושל הטיפות. שתי הדוגמאות שנבחרו הן גילוי של תאים בודדים בתוך טיפות ומיפוי של תהליכי ערבוב בתוך הטיפה הזורמת, המייצגות יישומים נפוצים הנחקרים כיום באמצעות מיקרופלואידיקה של טיפות.
כפי שמדגימים הניסויים המוצגים, השימוש בפלטפורמות מיקרופלואידיקה של טיפות מציג מאפיינים אטרקטיביים מסוימים, כגון תפוקה גבוהה עקב כלילה מושלמת ושחזוריות גבוהה יותר. כמות המידע הגדולה המופקת והמהירות הגבוהה שבה מידע זה נוצר, מחייבות שימוש בשיטות זיהוי מהירות בעלות רזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה ביותר, על מנת להפיק את מלוא התועלת מפלטפורמות ממוזערות אלו.
במקרה זה, אנו מדגימים כי הדבר אפשרי באמצעות טכניקות ספקטרוסקופיות פלואוריות ברמת דיוק גבוהה.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בפלטפורמות מיקרופלואידיקה מבוססות טיפות לניסויים בעלת תפוקה גבוהה. פלטפורמות אלו יכולות לייצר תאים מבודדים בנפח של picoliter בתדרים גבוהים, מה שמאפשר חילוץ וניתוח יעיל של נתונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ניסויים בתפוקה גבוהה
- ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- מיקרופלואידיקה של טיפות מאפשרת בקרה מדויקת על נפחים קטנים.
- ביטול דיבדובי (crosstalk) ופיזור משפרים את הדיוק האנליטי.
- היישומים כוללים PCR, סינתזה של ננו-חלקיקים ובדיקות של תא בודד.
- שילוב עם שיטות זיהוי רגישות הוא חיוני לצורך חילוץ נתונים.
מטרת המחקר
- פיתוח כלים לחילוץ כמויות גדולות של מידע ממערכות מיקרופלואידיות.
- הצגת שיטות לזיהוי תאים בודדים ומיפוי תהליכי ערבוב.
- שיפור הרגישות והישימות של שיטות הזיהוי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור שבבים מיקרופלואידיים באמצעות פוטוליתוגרפיה.
- הפקת טיפות באמצעות גאומטריות של מיקוד זרימה (flow focusing) וצומת-T.
- הסדרה אופטית לבדיקת טיפות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- שימוש בלייזרים עבור הדמיית זמן חיים של פלואורסצנציה.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של טיפות קטנות עד לגודל של מספר פמטוליטרים.
- פותחו שיטות זיהוי בעלות רגישות גבוהה.
- השיטות הדגימו כמיסה ואנליזה יעילים של דגימות.
- נקבעו פרוטוקולים ליישומים שונים במיקרופלואידיקה.
מסקנות
- פלטפורמות מבוססות טיפות יעילות עבור ניתוחים בתפוקה גבוהה.
- שילוב של שיטות זיהוי משפר את יכולות חילוץ הנתונים.
- ניתן להתאים פלטפורמות אלו למגוון רחב של יישומים מדעיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמות מיקרופלואידיקה של טיפות מאפשרות סריקה בתושבה גבוהה באמצעות יצירת תאים בנפח של פיקוליטרים המבטלים דיפוזיה וערבוב (cross-talk), ובכך תומכות בתזמון אנליטי מדויק. יכולת זו מגבירה את רמת הביטחון בחיזוי בשלבים מוקדמים של הגילוי, על ידי מתן אפשרות להערכה כמותית ומהירה של פרמטרים ביולוגיים וכימיים בקנה מידה רחב. שילוב עם שיטות רגישות לגילוי פלואורסצנציה מספק את הרזולוציה המרחבית והזמנית הדרושה כדי לנצל את המיניאטוריזציה להפחתת סיכונים בתהליכי תיקוף מטרות וזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות כליאה של תא בודד והערכת חיוניות באמצעות צבעים המשתלבים ב-DNA.
- ערך תפעולי: מקל על יצירת טיפות בתדר גבוה (בטווח של kHz) לצורך סריקה ניתנת להרחבה של אוכלוסיות תאים הטרוגניות.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד תגובות תאיות בנפחים מוגבלים, ובכך מפחית עמימות מכניסטית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות כמותיות של זמן חיים ועוצמת פלואורסצנציה למיפוי ערבוב מולקולרי וקינטיקה של תגובות בתוך טיפות.
- ערך תפעולי: מאפשר סטנדרטיזציה של תנאי הבדיקה באמצעות בקרה נפחית מדויקת ומניעת הפסדים עקב ספיחה לדפנות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תומך בזיהוי מרובה (multiplexed) באמצעות עירור על ידי לייזר כפול ופיצול ספקטרלי למדידה סימולטנית של פרמטרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך תרגומי: מקשר בין סריקה פנוטיפית בשלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני באמצעות כליאה הניתנת לשחזור של מערכות ביולוגיות מבוססות טיפות.
- הפחתת סיכונים: מגביר את הביטחון בבחירת המועמדים המובילים על ידי מתן אפשרות לניתוח רזולוציית-זמן של תהליכי ערבוב המשפיעים על יעילות התגובה ועקביות המוצר.
- רציפות: מקל על העברת פרוטוקולי טיפות מותאמים מ되גילוי מוקדם למודלים פרה-קליניים באמצעות ייצור שבבים סטנדרטי וגילוי אופטי.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד (Pipeline)
השיטה ממקמת את עצמה ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות ועד לזיהוי מובילים (lead identification), כאשר פלטים כמותיים מבוססי טיפות מספקים מידע לקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) לפני השקעה בשלב הפרה-קלניקה.
- ביולוגיית גילוי (Discovery Biology): תומכת בהבהרת מסלולים ובצמצום סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות לניתוח תאים בודדים ומיפוי קינטיקה של ערבוב במדורים מבודדים.
- סריקה (Screening): מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות זיהוי פלואורסצנציה ברגישות גבוהה שאינו הרסני, התואם ליצירה תכופה של טיפות.
- אנליזה: מספקת מדידות של זמן חיים ועוצמת פלואורסצנציה המאפשרות לצומים להשוות את התקדמות התגובה ואינטראקציות מולקולריות תחת תנאים מבוקרים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי יצירת נתונים הדירים וכמותיים מדגימות ביולוגיות עטופות, הישימים לאפיון תגובה למינון ורעילות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת פלטפורמה לשימוש חוזר, שבה ניתן להחיל שבבים מיקרופלואידיים והגדרות אופטיות סטנדרטיות על פני פרויקטים מרובים בכימיה, ביולוגיה ומדעי החומרים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות רזולוציה של תא בודד ומניעת הפרעות הדדיות (cross-talk) בפורמטים של תפוקה גבוהה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזוריות באמצעות יצירה מדויקת של טיפות וגילוי אופטי משולב.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות נתונים כמותיים עם רזולוציה קינטית מריאקטורים בנפח פיקוליטר.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של מועמדים מובילים באמצעות ניתוח ערבוב וחיוניות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בייצור שבבים מיקרופלואידיים, ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה וכיוון מיקרוסקופיה קונפוקלית.
- נדרש ציוד הכולל לייזרים פועמים, עדשות בעלות NA גבוה, מראות דיכרואיות, מסנני פליטה וגלאי ספירת פוטון בודד במתאם זמן (TCSPC).
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי יצירת טיפות ומיקום גששים אופטיים לצורך פירוש נתונים עקבי.
- כולל שיקולי התאמה בעת העברת פרוטוקולים בין סוגי תאים, ריאגנטים או גיאומטריות תעלות שונות.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בגישה לחדר נקי עבור ייצור התבנית הראשית ואופטימיזציה קפדנית של קצבי הזרימה כדי למנוע הרטבה של תעלות PDMS על ידי הפאזה המימית.
