צומת Murine שטחית לימפה ניתוח
21 במאי 2012
כדי לעקוב אחר ההתקדמות של תגובה חיסונית לאורך זמן בתוך העכבר זאת, בלוטות הלימפה ניתן להסיר ברצף על ידי ניתוח. כאן, אנו מתארים כיצד טכניקה זו ניתן לבצע.
המטרה הכללית של הליך זה היא להסיר בניתוח קשרי לימפה מעכבר תחת הרדמה. הדבר מושג תחילה על ידי איתור קשרי הלימפה. קשרי הלימפה נאספים, ולאחר מכן החתך נסגר.
לבסוף, ניתן להוציא תרחיף של תאים בודדים לצורך ניתוח ניסיוני. בסופו של דבר, ניתן להעריך אוכלוסיות של לימפוציטים חיוניים באמצעות ציטומטריה של זרימה. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא קריטית, שכן יש לצפות במיקום ובסילוק של קשרי הלימפה כדי לשלוט בביצוע הפעולה.
לאחר הרדמת העכבר, יש למרוח משחה לעיניים, להזריק בופרנורפין ולאשר את רמת הסדציה באמצעות צביטה בבהונות, ולאחר מכן להפנות את העכבר על צדו. ראשית, יש לאתר את קשרי הלימפה בבית השחי (brachial lymph node) ולאחר מכן לגלח את האזור המיועד לניתוח. לאחר הסרת שיער רופף בעזרת מברשת, יש למרוח חומר חיטוי על האזור ולבצע חתך קטן של כחמישה מילימטרים בגב הרגל האחורית.
השתמשו בשני זוגות פינצטות כדי למתוח את החתך עד שניתן יהיה לראות את קשרי הלימפה בזרוע (brachial lymph node), שעשויים להיראות אפורים או כהים יותר מהשומן שסביבם. לאחר מכן, צבטו עם זוג פינצטות אחד את הפציה המכסה את קשרי הלימפה. מקמו את זוג הפינצטות השני עמוק ככל האפשר מתחת לקשרי הלימפה ומשכו בעדינות את הממברנה מבלי לקרוע את הרקמה שסביבה.
לאחר מכן, השתמש בזוג הפינצטות הראשון כדי לקרוע את הפסציה ולהוציא את קשרי הלימפה. אם קשרי הלימפה נאספו בהצלחה, תופיע כתם דם במקום שבו שכן קשר הלימפה קודם לכן. הנח את קשרי הלימפה שהוצאו לתוך תמיסה איזוטונית; אם הם שוקעים, הדבר יאשר כי הרקמה שנאספה היא קשר לימפה ולא רקמת שומן.
בשלב הבא, ודאו שאין שערות בתוך הפצע וסגרו את החתך על ידי הצמדת שני קצות העור זה לזה וסיכיכם באמצעות אחד עד שני סיכות, בהתאם לגודל החתך. כעת, אתרו קשרית לימפה מפשעתית (inguinal lymph node) וגלחו את האזור המיועד לדיסקציה. לאחר הסרת שערות רופפות בעזרת מברשת, מרססו חומר חיטוי על האזור ובצעו חתך קטן של כ-5 מילימטרים מעל כף הרגל האחורית, סמוך לבטן.
לאחר פתיחת החתך באמצעות שני זוגות פינצטות כפי שהודגם זה עתה עבור קשרי הלימפה בבית השחי (brachial), זהו את קשרי הלימפה במפשעה (inguinal) השקועים בתוך רקמת השומן שסביבם. לאחר מכן, הוצא את קשרי הלימפה באמצעות שני זוגות הפינצטות כפי שהודגם. שוב, ודא כי השליפה של קשרי הלימפה הצליחה על ידי זיהוי כתם הדם המופיע במקום שבו שכן קשרי הלימפה קודם לכן, ולאחר מכן העבר את קשרי הלימפה מהמפשעה למכל נפרד המכיל תמיסה איזוטונית.
לאחר קציר כל קשרי הלימפה, העבירו את העכבר לכלוב והוסיפו מזון רטוב כדי שהעכבר יוכל להזין את עצמו בקלות. כשש עד שמונה שעות לאחר הניתוח, בדקו את העכבר כדי לוודא שאינו חווה כאב. התבוננו בקפידה שהיציבה, ההליכה, האינטראקציה עם בני מינו ומראה הפרווה דומים לאלו של עכבר בריא ונורמלי.
לבסוף, בצעו דיסוציאציה של קשרי הלימפה על ידי לחיצה עליהם כנגד זכוכיות כיסוי מטופלות (frosted slides) בתוך צלחת פטרי, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנה כדי לקבל תים של תאים בודדים (single cell suspension). לאחר צביעת התאים לאנטיגנים של פני השטח הרלוונטיים, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן מוצגות דוגמאות של תרשימי פיזור של פיזור קדימה (forward scatter) ופיזור צדי (side scatter) עבור קשרי לימפה שנלקחו מבעלי חיים שהורדמו או שהורגו.
הפרופילים ואחוזי התאים בשערי הלימפוציטים החיים בשני תרשימי הפיזור הם זהים. הדבר מוכיח שניתוח של קשרי לימפה הוא טכניקה מתאימה לאיסוף תאים. ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע את ניתוח קשרי הלימפה בתוך חמש עד 10 דקות לעכבר, במידה והוא מבוצע כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר טכניקה כירורגית להסרה רצפית של קשרי לימפה מעכבר תחת הרדמה, במטרה לעקוב אחר התגובה החיסונית לאורך זמן. הפרוצדורה כוללת איתור של קשרי הלימפה, הוצאתם וסגירת החתך, ולאחר מכן השגת תרחיף של תאים בודדים לצורך אנליזה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- טכניקות כירורגיות
- ניתוח ניסויי
רקע
- הבנת התגובות החיסוניות היא קריטית למחקר.
- קשרי לימפה ממלאים תפקיד מרכזי במערכת החיסון.
- הסרה רצפית מאפשרת ניתוח זמני של תגובות חיסוניות.
- טכניקות ויזואליות משפרות את הלמידה ואת השליטה בפרוצדורה.
מטרת המחקר
- להדגמת הסרה כירורגית של קשרי לימפה בעכברים.
- להקל על חקר התקדמות התגובה החיסונית.
- לספק מדריך חזותי עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איתור קשרי לימפה בעכבר תחת הרדמה.
- הסרה כירורגית של קשרי לימפה.
- סגירת החתך לאחר הניתוח.
- הכנת תרחיף תאים בודדים לצורך אנליזה.
תוצאות עיקריות
- הסרת קשרי הלימפה בוצעה בהצלחה.
- הושגו אוכלוסיות לימפוציטים חיוניות.
- נעשה שימוש בציטומטריית זרימה להערכת הלימפוציטים.
- הדגמות חזותיות שיפרו את הבנת הטכניקה.
מסקנות
- הטכניקה מאפשרת מעקב יעיל אחר תגובות חיסוניות.
- עזרים ויזואליים חיוניים לשליטה בהליכים כירורגיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו להשגת תובנות עמוקות יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח רצפי של קשרי לימפה מאפשר מעקב אורך של תגובות חיסוניות באותו בעל חיים, ובכך מפחית את השונות הניסויית ותומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בתהליך של תיקוף מטרה. גישה זו מספקת כמות מספקת של לימפוציטים חיים עבור בדיקות פנוטיפיות ותפקודיות, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי במחקרי אימונולוגיה פרה-קליניים. באמצעות יישום ניסויי מסלול זמן, הטכניקה תומכת ברציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ניתוח זמני של התרחבות לימפוציטים בקשרי לימפה.
- ערך תפעולי: מפחית את מספר בעלי החיים בשימוש ואת השונות הניסויית על ידי ביצוע דגימות חוזרות באותו עכבר.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות אפיון של פנוטיפים של לימפוציטים השוכנים בקשרי לימפה לאורך זמן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מניב 1-2x10⁶ תאים לבלת לימפה, כמות המספיקה לאפיון פנוטיפי ובדיקות תפקודיות.
- ערך תפעולי: מספק תרחיפי תאים סטנדרטיים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח המשך באמצעות ציטומטריית זרימה.
- ערך מדעי: מאפשר הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות להערכה מהימנה של תרכובות בסריקה אימונולוגית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: תומך במידול מערכות רלוונטי למחלה באמצעות מעקב אחר דינמיקה של תאי חיסון בקשרי לימפה לאורך זמן.
- ערך תפעולי: מסייע בהלימה של ביומרקרים תרגומיים באמצעות ניטור חיסוני אורך.
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים מכניסטית של נתיבים המתווכים על ידי מערכת החיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומכת במעקב אחר תגובה חיסונית ובניתוח תפקודי של לימפוציטים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות פרופיל זמני של התגובה החיסונית.
- סריקה: מאפשר מוכנות של הבדיקה באמצעות תרחיפי תאים בודדים הניתנים לשחזור מקשרי לימפה שנאספו.
- אנליטיקה: מייצר אוכלוסיות לימפוציטים כמותיות להשוואה מבוססת ציטומטריה של זרימה בין נקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הגילוי לתיקוף פרה-קליני באמצעות ניטור חיסוני רציף במערכות הרלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת כירורגית לשימוש חוזר עבור מחקרי אימונולוגיה אורכיים לאורך פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות מעקב ארוך טווח אחר התגובה החיסונית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באיסוף ועיבוד של לימפוציטים.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת הפיתוח (go/no-go) באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית בתוכניות אימונולוגיות.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתוני תגובה חיסונית זמנית מדגימות רצופות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטכניקות כירורגיות בעכברים ובפרוטוקולי הרדמה.
- דורש מכשור סטרילי ותמיסות איזוטוניות לשימור רקמות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך לוקליזציה ואיסוף עקביים של קשרי לימפה.
- כולל שיקולי התאמה עבור אתרי קשרי לימפה שונים (זרוע, מפשעה) וזני עכברים שונים.
- מוגבל על ידי מרווחי ההחלמה לאחר הניתוח, מה שמאפשר דגימה בכל יום שני לכל צומת.
