זיהוי של היפוקסיה Microregional בקליפת עכבר מוחין על ידי הדמיה של שני הפוטונים אנדוגני NADH Fluorescence
21 בפברואר 2012
כאן אנו מתארים את שיטת ישירות לדמיין היפוקסיה ברקמות microregional של קליפת המוח העכבר In vivo. היא מבוססת על הדמיה של שני פוטונים בו זמנית של dinucleotide nicotinamide אדנין (NADH) ו microcirculation קליפת המוח. שיטה זו שימושית לצורך ניתוח ברזולוציה גבוהה של אספקת החמצן לרקמות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ויזואליזציה ישירה של היפוקסיה רקמתית מיקרו-אזורית בקורטקס של עכבר in vivo. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת חלון גולגולת פתוח בעכבר תחת הרדמה. לאחר מכן, מוזרק צבע פלואורסצנטי באופן תוורידי כדי לסמן את כלי הדם המוחיים.
לבסוף, מבוצע דימוי פוטוני בו-זמנית של פלואורסצנציית NADH אינטרינזית ושל מיקרו-כלי הדם הקורטיקליים המסומנים פלואורסצנטית. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות היפוקסיה פונקציונלית באזורי מיקרו של פרנכימה מוחית באמצעות ויזואליזציה של נוכחות הצורה הרדוכית של nicotinamide, adenine dinucleotide. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אלקטרודות מסוג Clark, הוא שהיא מספקת רזולוציה מרחבית גבוהה על פני שדה ראייה רחב, והיא גם פחות פולשנית.
ניתן לבצע שיטה זו במערכת צילום פלואורסצנציה סטנדרטית בעלת שני ערוצים. שלום, אני סטיב הרסט, פרופסור וראש המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת רוצ'סטר. מי שתדגים את הפרוצדורה היום היא אניטה סון ממעבדתו של קישקה, וכן אוקסנה פולקה, פרופסורית עזר למחקר מהמעבדה שלי. ד"ר קישקה, שהוביל את פיתוח טכניקת הדימות של NADH, אינו יכול להיות כאן היום מכיוון שעבר לאחרונה לגרמניה. לאחר הכנת אזור הניתוח עם הכלים הדרושים שעברו עיקור באוטוקלאב או חיטוי ב-70% ethanol, ולאחר הרדמת העכבר באמצעות 5% isof fluorine, הניחו אותו על פד חימום והניחו מסכה על פניו להזרמת 1.3 עד 1.5% isof fluorine באוויר.
בדקו את רמת ההרדמה באמצעות צביטה בזנב. לאחר מכן, הכניסו גשש רקטלי ומדדו באופן רציף את חום גופו של בעל החיים לאורך הפרוצדורה. מרחו ג'ל דמעות מלאכותיות על עיני העכבר כדי למנוע את התייבשותן.
לאחר מכן, הסר את הפרווה מהראש ומשתי הירכיים; מרח מסיר שיער על הירך למשך שתי דקות להסרת הפרווה שנותרה, שכן הירך תשמש למדידת אוקסימטריה. לבסוף, חטא את הקרקפת באמצעות תמיסת povidone iodine 10% ו-ethanol 70%. ליצירת חלון גולגולתי, התחל חמישה מילימטרים מהגולגולת באמצעות מספריים.
בצעו חתך בקרקפת והתקדמו סנטימטר אחד. הסיטו את העור לצדדים כדי לחשוף את הגולגולת ולהסיר את הקרומים שמעליה. מרססו תמיסת ferric chloride בריכוז 10%.
נגבו את עודפי התמיסה וגרדו את הממברנות בזווית של 45 מעלות. מספר חמש, פינצטה. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, זהו את אזור העניין. מרחו שכבה דקה של דבק מהיר מסביב לקצוות החלון של לוחית הראש.
מקמו את לוחית הראש באופן שבו אזור העניין חשוף בחלון והפעילו לחץ קל על לוחית הראש. מרחו כמות קטנה של צמנט דנטלי כדי לפולמריז את הדבק במהירות. החזיקו למשך 10 שניות בזמן שהדבק עובר פולמריזציה.
מרחו כמות קטנה של דבק מהיר לקצוות החלון כדי לאטום את לוחית הראש ואת הגולגולת. לאחר מכן, הבריגו את לוחית הראש למחזיק בעל החיים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. השתמשו בסט מקדחות micro torque two המכוון ל-6,000 RPM ובמקדח IRF 0 0 5.
הסר את כל שאריות הדבק מהגולגולת ומלוחית הראש. לאחר מכן, כוון את המקדחה ל-1000 RPM והתחל לקדוח בגולגולת על ידי יצירת מעגל בתוך חלון לוחית הראש בקוטר של כ-5 מילימטרים. השתמש בתנועות סריקה קלות, כאילו אתה מצייר בעיפרון רך מאוד.
יש להפסיק את הקידוח מדי 20 עד 30 שניות ולהשתמש באוויר דחוס להסרת שבבי העצם. ככל שהקידוח מתקדם, נוצר חלל מסביב לגולגולת השלמה במרכז. יש להיזהר לא לנקב את הגולגולת הדקה, אך לוודא שחלל זה הוא בעובי אחיד.
בנוסף, יש לנהוג בזהירות יתרה בסביבת כלי דם גדולים. אין לפגוע בהם, ובמידת האפשר, אין אף לגעת בהם. בעזרת שיננית אחת של פינצטה, הרימו את העצם במרכז החלון והניחו טיפה של נוזל חוט שדרה מלאכותי על החלון. בעזרת פינה של נייר ניגוב מסוג Kimwipe, נגבו בעדינות את נוזל חוט השדרה המלאכותי בזווית של 45 מעלות.
מספר חמש, פינצטה. אתרו אזור של דורה פגועה לאורך קצה החלון והרימו אותה כדי להסירה. אם מופיע דימום, טפטפו טיפה של CSF מלאכותי והמתינו שתי עד שלוש דקות עד להפסקת דימומים קלים.
בשלב הבא, הכינו 10 milliliters של 0.07% low melting aero המומס בנוזל צרברום מלאכותי. הביאו את ה-aeros המומס לטמפרטורת הגוף. נגבו את עודפי הנוזל הצרברום המלאכותי מפני השטח של המוח.
שפכו את ה-aeros לחלונית וכסו אותה בzזכוכית כיסוי. לאחר מכן, לחצו בעדינות על הזכוכית כדי ליצור מגע בין הזכוכית לבין לוחית הראש והמתינו 10 עד 20 שניות עד שה-aero יתמצק. בעזרת פינצטה ונייר סופג רך, הסירו את עודפי ה-aero מזכוכית הכיסוי.
מרחו כמות קטנה של דבק מהיר סביב הזכוכית כדי להדביקה ללוחית הראש. לאחר מכן, מרחו כמות קטנה של צמנט דנטלי כדי לייצב את הדבק להזרקה לווריד הפמורלי. הפכו את בעל החיים חלקית כדי לחשוף את החלק הפנימי של הירך השמאלית.
השתמשו בסרט דביק כדי לקבע את החיה. במצב זה, מרחו תמיסת חיטוי, ולאחר מכן אתנול 100% על העור. לאחר מכן, בצעו חתך לאורך הירך המדיאלית, מהברך ועד לסינתזיס הפוביס.
במידת הצורך, הפרד את הרכים באמצעות דיסקציה קהה. מלא מזרק של 1 mL ב-130 µL של Texas red. חבר מחט חדשה בכיול 30 וכופף אותה בזהירות בזווית של 30 מעלות, כאשר פיית המחט פונה כלפי מעלה.
מלאו את המחט בתמיסת Texas Red תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הכניסו את המחט לווריד הפמורלי והזריקו 100 µL של Texas red. הוציאו את המחט ולחצו קלות על הווריד בעזרת גזה כדי לעצור את הדימום. סגרו את העור באמצעות תפר 4-0 לצורך ניטור רציף של רמת רוויית החמצן בדם.
הנח את חיישן האוקסימטר על הירך הימנית ממנה הוסר השיער קודם לכן. כדי להתחיל בדימות, העבר את העכבר שהוכן כירורגית למבנית המיקרוסקופ. צלם תמונה ראשונית של אזור החלון הגולגולתי באמצעות תאורת שדה בהיר (Bright Field) בהגדלה של פי ארבע, כדי להשתמש בה כמפת ייחוס לרישום עם הגדלה גבוהה יותר לצילום פוטוני.
בצעו הגדלה של אזור העניין באמצעות הגדלה של 10x. בחרו אזור עניין בשכבות הקורטקס. לחצו פעם אחת או פעמיים כדי להתחיל בהקלטת סדרת הזמנים.
אנו ממליצים להשתמש בממוצע של שלושה עד חמישה פריימים כדי להעלות את איכות התמונה. לאחר מכן, גרמו להיפוקסמיה על ידי הוספת 50% nitrogen לאוויר שבו נושמת החיה. פעולה זו תביא את רמת החמצן ל-10%. ודאו את קיומה של ההיפוקסמיה באמצעות ניטור נתוני האוקסימטר.
המשיכו להקליט את סדרת הזמנים לאורך תקופת ההיפוקסמיה למשך כ-30 שניות ועד לאחר השבתו של רמת חמצן נורמלית. אספו נתונים לחישוב פיזור החמצן על ידי זיהוי, מדידה וכמות של שטח ההיפוקסיה ושל גלילי הרקמה המחומצנת סביב כלי הדם. כדי לקבוע את רדיוס גליל הרקמה R, מדדו את המרחק בין מרכז כלי הדם לבין הגבול שבו מזוהה פלואורסצנציית NADH גבוהה.
יש לעיין בפרוטוקול הכתוב לגבי שיטות עיבוד הנתונים. איור זה מציג תמונות NADH וגאוגרפיה סימולטניות מווידאו שהוקלט במהלך היפוקסמיה חולפת, כאשר ריכוז החמצן בשאיפה הופחת מ-21% ל-10% למשך תקופה של שלוש דקות. רמה זו של היפוקסמיה המושרה ניסויית מספיקה כדי לגרום להיפוקסיה חמורה בקליפת המוח (cerebral cortex).
היפוקסיה הובילה לעלייה בفلורסצנציית NADH, המוצגת בירוק, בתחילה באזורים הרחוקים ביותר מאספקת הדם העורקית. שימו לב לגבולות רקמת ה-NADH החדים, המייצגים גבולות רקמה נצפים של דיפוזיית חמצן מהמיקרוסירקולציה הקורטיקלית המוצגת באדום. להלן תמונה מקבילה של מיקרו-כלי דם מסומנים פלואורסצנטית בקליפת המוח באדום, ושל פלורסצנציית NADH אינטרינזית מהחומר האפור של קליפת המוח בירוק; התפלגות עוצמת פלורסצנציית ה-NADH היא בינארית.
ישנם אזורים עם פלואורסצנציית NADH נמוכה באופן אחיד ואזורים עם פלואורסצנציית NADH גבוהה באופן אחיד. הקווים הצהובים מייצגים את גבולות הרקמה בין האזורים עם פלואורסצנציית NADH נמוכה לגבוהה. גבולות רקמה אלה מראים קשר מרחבי לכלי דם זעירים סמוכים.
קשר זה נקבע על ידי דיפוזיה של חמצן מהמיקרוכליים אל תוך הרקמה. במקרים מסוימים, ניתן לזהות באופן ישיר את הטבע הגלילי או את גליל הרקמה של ה-CRO בגבולות רקמתיים אלו, כפי שמסומן בקוים הכחולים. כאן, גבול הרקמה הוא בצורה מעגלית עם כלי דם מרכזי קונצנטרי לאחר השליטה בטכניקה.
ניתן לבצע טכניקה זו בתוך 1.5 שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להדביק את זכוכית הכיסוי לפלטת המתכת כדי למנוע תנועה אנכית של פני השטח הקורטיקליים עקב בצקת. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע ניתוחים נוספים, כגון מדידות של היפרמיה פונקציונלית, במטרה להתייחס לשאלות נוספות כגון הקשר בין היפוקסיה של רקמות לבין צימוד קרבו-ווסקולרי.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לדמות ויזואלית היפוקסיה רקומית אזורית מיקרוסקופית בקורטקס של עכבר.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להדמיית היפוקסיה רקתית מיקרו-אזורית בקליפת המוח של עכבר in vivo באמצעות דימוי דו-פוטוני. הטכניקה מאפשרת ניתוח ברזולוציה גבוהה של אספקת החמצן לרקמה על ידי הדמיה סימולטנית של NADH ושל המיקרו-סירקולציה הקורטיקלית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- פיזיולוגיה
רקע
- היפוקסיה של רקמות היא גורם קריטי במצבים נוירולוגיים שונים.
- שיטות מסורתיות למדידת רמות חמצן עלולות להיות פולשניות ופחות מדויקות.
- דימוי דו-פוטוני מציע חלופה פחות פולשנית עם רזולוציה מרחבית גבוהה יותר.
- NADH הוא אינדיקטור מרכזי למצב המטבולי התאי ולזמינות החמצן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לוויזואליזציה בזמן אמת של היפוקסיה ברקמות בקליפת המוח של עכבר.
- שיפור ההבנה של אספקת החמצן באזורים מיקרו-ภูมิקוליים ברקמת המוח.
- אספקת טכניקה פחות פולשנית בהשוואה לשיטות קיימות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנה של חלון גולגולת פתוח בעכברים תחת הרדמה.
- הזרקה תוורידית של צבע פלואורסצנטי לסימון כלי דם מוחיים.
- דימוי דו-פוטוני סימולטני של פלואורסצנציית NADH ושל המיקרו-וסקולטורה.
- ניטור של רמת רוויית החמצן בדם במהלך הדימוי.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של היפוקסיה תפקודית במיקרו-אזורים במוח.
- התקבלו תמונות ברזולוציה מרחבית גבוהה של NADH וכלי דם.
- השיטה הראתה פחות פולשנות בהשוואה לטכניקות מסורתיות.
- התוצאות מצביעות על פוטנציאל להבנה משופרת של חילוף החומרים במוח.
מסקנות
- השיטה שפותחה מספקת כלי בעל ערך לחקר היפוקסיה ברקמה.
- היא משפרת את היכולת לנתח את אספקת החמצן במוח.
- טכניקה זו עשויה להוביל לתובנות חדשות לגבי הפרעות נוירולוגיות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
ויזואליזציה ישירה של היפוקסיה מיקרו-אזורית בקורטקס של עכבר באמצעות דימות NADH דו-פוטוני נותנת מענה לפער קריטי בהבנת חמצון הרקמה ברזולוציה מרחבית גבוהה. יכולת זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות נוירו-וסקולריות ותומכת בביטחון חיזוי בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). התוצאות הכמותיות והלא-פולשניות של השיטה מספקות מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו במקרים שבהם אספקת חמצן ועקה מטבולית הם גורמי סיכון מרכזיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולים מטבוליים נוירו-וסקולריים תחת עקה היפוקסית.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מיפוי מדרגי חמצן ופגיעות רקמות.
- מסייע בביטחון חיזויי בבחירת מטרות הקשורות לפתולוגיה המונעת מהיפוקסיה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo מתוּקפת לכימות פלואורסצנציית NADH כסמן ביולוגי להיפוקסיה.
- מאפשר הערכה כמותית וניתנת לשחזור של חמצון רקמות תחת תנאים ניסויים שונים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה לצורך הערכת השפעות של תרכובות על אספקת חמצן מיקרו-אזורית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מותאם למודלים רלוונטיים למחלות של פגיעה נוירו-וסקולרית ושבץ.
- מאפשר רצף מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות המווסתות היפוקסיה.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של מועמדים המכוונים לאספקת חמצן או לעמידות מטבולית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פרוטוקול דימות זה משתלב ברצף השלב של הגילוי ועד לשלב הפרה-קליני עבור תוכניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) ומערכת כלי הדם העצביים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת השערות על דיפוזיה של חמצן ומטען מטבולי ברקמת מוח.
- סריקה: מספק קריאות פלואורסצנציה של NADH כמותיות וניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשר מיפוי מרחבי והשוואה סטטיסטית בין אזורים היפוקסיים לאזורים מחומצנים.
- מחקר תרגומי: מספק רציפות מכניסטית עבור מודלים פרה-קליניים של שבץ ומחלות נוירו-וסקולריות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת דימות ניתנת לשימוש חוזר למחקרים מגוונים של היפוקסיה במערכת העצבים המרכזית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות נוירו-וסקולריות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של מדידת היפוקסיה in vivo עם רזולוציה מרחבית גבוהה ויכולת שחזור.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go עבור תוכניות CNS על ידי הבהרת גורמי סיכון של חמצון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של נכסים המכוונים למנגנונים מטבוליים או וסקולריים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה של שני פוטונים ובהכנה כירורגית in vivo.
- נדרשת גישה למערכות הדמיה סטנדרטיות של שני פוטונים עם ערוצי פלואורסצנציה כפולים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים עבור פרוטוקולי הדמיה וניתוח נתונים.
- התאמה לאזורי מוח אחרים או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות פוטנציאליות כוללות מורכבות כירורגית וצורך בוויסות מדויק של חמצן.
