מרובב יחיד מולקולה proteolysis חיל מדידות באמצעות מלקטת מגנטיים

המטרה הכללית של הליך זה היא לחקור את השפעת העומס המכני על פירוק פרוטאוליטי של חלבונים בודדים באופן מקבילי מאוד וחסכוני. בהדגמה זו, נבחן את פירוק הקולגן על ידי matrix metalloproteinase one; בשלב הראשון, מוצמדים קוצצי קולגן (collagen trimmers) לכיסוי הזכוכית של תא זרימה, ולאחר מכן מוצמדים חרוזי מגנט בגודל מיקרומטר למולקולות קולגן בודדות. השלב השני הוא התקנת תא הזרימה במכשיר הפינצטה המגנטית ובדיקה שחרוזים שהוצמדו באופן לא ספציפי הוסרו מפני השטח של כיסוי הזכוכית.

בשלב הבא, מוסיפים את הפרוטאז לתאי הזרימה. השלב האחרון הוא קביעת קצב הפרוטאוליזה על ידי ניטור ניתוק חרוזיים בזמן אמת. על ידי מדידת קצבי ניתוק החרוזיים בריכוזי פרוטאז ובכוחות משתנים, ניתן לגזור פרמטרים קינטיים זואולוגיים סטנדרטיים תוך שימוש בכמויות מזעריות של סובסטרט ופרוטאז.

בנוסף, טכניקה זו מספקת מידע ייחודי על השפעת כוח מכני על קצב הפרוטאוליזה ועל השינויים המבניים בחלבון המצע הנלווים לבקיעה. היתרון המרכזי של טכניקה זו בהשוואה לשיטות אחרות, כגון עקבות T אופטיות ומיקרוסקופיית כוח אטומי, הוא שהיא בעלת תפוקה גבוהה וכלכלית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הכוח האפקטיבי על הבקיעה הפרוטאוליטית של חלבונים בודדים, ניתן ליישם את המכשור והטכניקות על מגוון רחב של בעיות ביופיזיות, כולל השפעת כוח על קיפול חלבונים וקונפורמציה.

התחילו את הכנת תא הזרימה על ידי ניקוי של לבישי כיסוי באמצעות סוניקציה. הכניסו את לבישי הכיסוי למכל זכוכית קטן המתאים להם ונכנס למכשיר הסוניקטור. מלאו את המכל באיזופרופנול ובצעו סוניקציה באמבט סוניקציה למשך 20 דקות, לאחר מכן רוקנו את האיזופרופנול ושטפו את לבישי הכיסוי בכמויות רבות של מים דה-יוניים.

מלאו את המיכל במים ובצעו סוניקציה למשך 20 דקות. לאחר הסוניקציה, ייבשו את לוחות הכיסוי בזרם של אוויר מסונן נקי מאבק. בדקו את לוחות הכיסוי והשתמשו רק באלו הנקיים מכתמים.

חממו בעדינות את לבישי הכיסוי במשך מספר שניות כדי לנקות אותם מאבק ומלחות שנותרו, וזאת על ידי העברת לבישי הכיסוי בלהבה של מבער בנזן, תוך הקפדה שלא לעוות את לביש הכיסוי עקב חום מרובה. שלב זה מסיר מזהמים שנותרו על פני השטח.

בשלב הבא, השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי לחבר את שתי זכוכיות הכיסוי זו לזו. גזרו תחילה את הסרט לאורך של כ-3 סנטימטרים וברוחב של 0.3 סנטימטרים, והדביקו אותו לזכוכית כיסוי בגודל 22 על 40 מילימטר, כך שיישאר תעלה של 1.6 סנטימטר במרכז. השתמשו בטיפ של פיפטה כדי ללחוץ בעדינות על זכוכית הכיסוי כדי להבטיח שהסרט נדבק כראוי.

מערך הפינצטה המגנטית נבנה במעבדה זו באמצעות תומך אלומיניום בצורת L עם חור סיכה בקוטר של one millimeter, והוא הותקן על מתרגם Z אנכי כדי לווסת את גובה הפינצטה. שני מגנטים קבועים של נדיר-עפר הוצמדו לתומך משני צדי חור הסיכה כדי ליצור את מפל המגנטים. כיול תקין של המלכודת המגנטית חיוני להליך זה.

על מנת להבטיח הצלחה, אנו משתמשים בשתי שיטות שונות כפי שמתואר בסעיף זה. לצורך כיול המלכודת המגנטית, השתמשו ב-DNA שהוכן מראש מפאג' Lambda, המסומן בקצות ה-5' וה-3' שלו בביוטין וב-doxygen כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להצמיד את ה-DNA לתא הזרימה, מלאו תחילה את תא הזרימה בתמיסת נוגדן נגד D oxygen ואפשרו לנוגדן להיצמד למשטח הזכוכית למשך 15 דקות.

בשלב הבא, חסמו את פני השטח של תא הזרימה כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של DNA על ידי הוספת תמיסת BSA לתא הזרימה. שימו לב כי עבור שלב חסימה זה וכל השלבים הבאים, נפח הריאגנט המתווסף לתא הזרימה צריך להיות לפחות פי שניים מנפח התא. נפח תא הזרימה, שבהדגמה זו הוא 75 microliters, דגרו את תא הזרימה בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.

לאחר חזרה על שלב זה, הוסיפו 50 pico molar של lambda DNA פונקציונלי ו permitan לו להיקשר ללוחית הזכוכית (cover slip) למשך 15 דקות, ושטפו את ה-DNA העודף באמצעות XPBS אחד. לבסוף, הוסיפו חרוזי סופר-פרמגנטיים מצופים בסטראפטאבידין (streptavidin) והניחו להם להיקשר ל-DNA המקובע למשך 15 דקות. בהדגמה זו נעשה שימוש בחרוזים בקוטר 2.8 micrometer.

שטפו עודפי חרוצים באמצעות XPBS אחד. לאחר מכן, בצעו כיול של הפינצטה המגנטית על ידי הזזת המגנטים הקבועים למצב הרחוק מפני שטח הדגימה. לאחר מכן, הניחו את תא הזרימה שהוכן במיקרוסקופ.

העבירו את המגנטים הקבועים למיקום מעל תא הזרימה. בחרו את מישור המיקוד של חרוזי Lambda DNA פונקציונליים על ידי מיקוד על החרוזים הרחוקים משני משטחי הזכוכית. מישור המיקוד הנכון הוא זה שבו למרכז החרוזים הרצויים יש מראה בהיר.

צלמו וידאו של תנועת החרוצים בשיעור של 80 hertz למשך 500 פריימים. קרבו את המגנט לפני השטח של הדגימה והקליטו וידאו של תנועת החרוצים בכל מיקום. עבור מרחקים הגדולים מחמישה מילימטרים, התקדמו במרווחים של מילימטר אחד; עבור מרחקים שבין מילימטר אחד לחמישה מילימטרים, התקדמו במרווחים של מילימטר אחד.

הזז במרווחים של 0.5 millimeter למרחקים קטנים ממילימטר אחד, ובמרווחים של 0.25 millimeter עבור מרחקים קצרים יותר. עבור כל סט נתונים, עקב אחר מרכז החרו지를 באמצעות התאמת Gaussian בדו-ממד (2D). חשב את הכוח באמצעות תנודות בראוניאניות (brownian fluctuations) כפי שמתואר בנוהל הכתוב. אשר את דיוק הכוחות על ידי בדיקת חישוב הכוח באמצעות התאמת קו ליניארי (Lian fit) של ספקטרום ההספק.

על מנת למצוא את תדר ה-roll off, ניתן למצוא את הקשר בין הכוח המופעל לבין תדר ה-roll off בטקסט שקדם להיצמדות פפטיד קולגן לתאי זרימה, ביטוי וניקוי של פפטיד הקולגן וחלבון MMP one. התחל בהוספת תמיסת נוגדן anti mic לתא הזרימה והדגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות כדי לאפשר ל-anti mic להיצמד לפני השטח של תא הזרימה; חסום את תא הזרימה כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של חלבונים באמצעות 5 mg/mL BSA. הוסף 150 pM פפטיד קולגן ואפשר לו להיצמד לנוגדן באמצעות תג M ttag למשך 45 דקות.

שטפו את עודפי הקולגן באמצעות בופר PBS לפני הוספת חרוצים בגודל 2.8 µm לתא הזרימה. יש להפרידם מהתמיסה של ה-strep divid והחרוצים המצופים באמצעות מגנטים חזקים, ולאחר מכן לתלה אותם מחדש ב-PBS. יש לחזור על תהליך זה שלוש פעמים.

שלב זה חיוני כדי לגרום לחרו지를 בגודל 2.8 micrometer להיקשר לפפטיד קולגן המקובע על פני השטח. לאחר מכן, הוסף חרוזים סופר-פרמגנטיים מצופים בstreptavidin ואפשר להם להיקשר למולקולות הקולגן למשך 45 דקות. לאחר הרכבת תא הזרימה עם פפטיד הקולגן והחרוזים המגנטיים, בצע הדמיה של תא הזרימה במלכודת המגנטית.

תחת כוח נמוך, תת-אוכלוסייה של חרו지를 היא לעיתים חלשה, ונדבקת למשטח באופן לא ספציפי. הפעלת כוח מתון מבטיחה שחרוזים אלו ישוחררו. הוסף אנזים מופעל לתא הזרימה.

במקרה זה, MMP 1 הופעל מראש על ידי הוספת 3.5 mM PMA ודגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך שלוש שעות. מיד עם החזרת תא הזרימה למכשיר הפינצטות המגנטיות, הקליטו וידאו המקיף מספר שדות ראייה, שבדרך כלל יניב כמה מאות חרוזיים קשורים. מדידה זו תואמת לזמן שווה ל-0.

חזור על אותו תהליך של הקלטת מספר שדות ראייה בנקודות זמן קבועות עד שכל החרו지를 ניתקים או עד שלא ניתן להבחין בפרוטאוליזה נוספת. הפינצטה המגנטית כויילה עבור חרוזים של 1 µm ו-2.8 µm. באמצעות גודל התנודות הברוניאניות שנצפו וחישוב תדר ה-roll-off במיקומים משתנים של המגנט בניסויי הפרוטאוליזה הכפויה, ניתן לשרטט את מספר החרוזים שנותרו בנורמליזציה כפונקציה של זמן כדי למצוא את קצב הפרוטאוליזה.

ניתן לחזור על תהליך זה עבור ריכוזי אנזימים וכוחות משתנים. קצבי הפרוטאוליזה תלויים בכוח המופעל. קצבי הפרוטאוליזה נקבעו עבור 1 pN, 6.2 pN ו-13 pN.

חלקם של החרוזים שלא נפתחו לאחר יותר מ-15 דקות נשאר קבוע בקירוב על 0.25 בניסויים שונים. במקרה שלנו, הבדיקה אפשרה לנו למדוד את היעילות הקטליטית של MMP1 כפונקציה של הכוח המופעל. מניתוח הנתונים מצאנו כי סליל השלשה של הקולגן חייב להיפתח מקומית לפני הפרוטאוליזה.

ברגע שהטכניקה תשלט, ניתן לבצעה תוך חמש עד שש שעות אם היא מבוצעת כהלכה. חשוב לזכור כי נדרשים לפחות 30 עד 50 חרוצים לשדה ראייה כדי להשיג מובהקות סטטיסטית טובה של הנתונים. אין לשכוח כי PMA עלול להיות מסוכן ביותר, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות כגון כפפות, חלוקי מעבדה ומסכות פנים במהלך ביצוע ניסוי זה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד את השפעת כוח על פירוק פרוטאוטי של חלבונים בודדים באמצעות פינצטות מגנטיות. הפינצטות המגנטיות הן כלי מצוין להבנת ניסויים ביופיזיקליים של מולקולות בודדות. ניתן להרחיב טכניקה זו לשילובים אחרים של פרוטאזות ותסריטים.

בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקות דומות כדי להבין את הדינמיקה המבנית של חלבונים, וכן כדי להבין חלבונים אחרים נקשרים ל-RNA ו/או DNA או משנים אותם.