מידול והדמיה 3-Dimensional Cell קיבוציים Invasion

מערכת ניסויית זו נועדה לאפיין את תרומתם של חלבונים ספציפיים לתהליך הפלישה. התחילו בטרנסדוקציה רטרו-ויראלית של תאים עם החלבון הפלואורסצנטי הרלוונטי. כמו כן, צרו מטריצה תלת-ממדית של חלבון matrigel במסנני transwell, והכינו תרחיף תאים בדילול המתאים.

בעזרת מערכת ה-Matrigel transwell, מדדו את תגובת המעבר (transmigration) למשיכה כימית בנוכחות תרופות או טיפולים נבדקים, ולאחר מכן עברו לוויזואליזציה וניתוח של פלישת התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. בסופו של דבר, התוצאות יכולות לקבוע את העוצמה ואת אופן פלישת התאים אל תוך מטריצת חלבון תלת-ממדית. יתרונה של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקת פלישת Transwell המסורתית, הוא יכולתה לספק נתונים כמותיים ואיכותיים כאחד על פלישת תאים לתוך מטריצת חלבון תלת-ממדית.

עמיתתי למחקר, Diane Creighton, תדגים כעת את השיטה: יש לגדל תאי אריזה רטרו-ויראליים ב-DMEM המכיל 10%FBS למשך 48 שעות. בצע טרנספקציה לתאים באמצעות DNA רטרו-ויראלי בהתאם להוראות היצרן. הדגר למשך 24 שעות, שטוף את הבארים פעמיים עם מצע גידול, לאחר מכן הוסף 1.5 milliliters של 10%F-P-S-D-M-E-M לכל באר, והדגר למשך 48 שעות כדי לאסוף את ה-Retrovirus הארוז.

העבירו את מצע תרבית הרקמה למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר, צנטריפוגו כדי לשקע את התאים ואספו את הנוזל העליון למבחנה נקייה. אחסנו מלאי רטרו-וירוס זה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. כעת, כדי לבצע טרנסדוקציה רטרו-וירוסית לתאים, הסירו את המצע מתרבית שגדלה בן לילה והוסיפו מיליליטר אחד של מלאי רטרו-וירוס בתוספת poly green.

לאחר דגירה של שש שעות, הוסיפו שתי מיליליטר של 10%F-B-S-D-M-E-M לבאר והניחו את הפלטות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C. במהלך הלילה, חדשו את המצע, ולאחר 24 שעות, הוסיפו מצע סלקטיבי מתאים. כאשר התאים יגיעו למצב של התלכדות (confluent), קצרו את התאים ומיינו אותם לפי פלואורסצנציה, תוך שימוש בתאים שאינם טרנסדוקים כביקורת. אספו תאים עם פלואורסצנציה הגבוהה מזו של התאים שאינם טרנסדוקים והקפיאו מנות (aliquots) בטמפרטורה של 80- °C לשימוש עתידי.

שיטה זו מתבססת על ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים לצורך ויזואליזציה, ומאפשרת לקבוע את התרומה של תאים בודדים. הפסק את הפשרת ה-Matrigel על קרח, ולאחר מכן דלל אותו ביחס של 1:1 ב-PBS קר מאוד. כעת, הכנס את ה-transwells שאינם מצופים לתוך פלטת תרבית רקמה בעלת 24 בארות.

לאחר מכן, העבירו בזהירות באמצעות פיפטה 100 µL של Matrigel מדולל לתוך הבארים והקשיחו בטמפרטורה של 37 °C. במקביל, הכינו את תרחיפי התאים המסומנים פלואורסצנטית במצע growth medium רגיל. לאחר שה-Matrigel התקשח, הפכו את ה-transwells והעבירו בפיפטה 100 µL של תרחף התאים אל הצד התחתון של המסנן הפונה כלפי חוץ.

כסו בזהירות את ה-transwells בעזרת הבסיס של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארות, כך שיהיה מגע עם כל טיפה של תמיחת התאים. דגרו את הפלטה במצב הפוך למשך ארבע שעות כדי לאפשר היצמדות של התאים. כעת הפכו את הפלטות חזרה למצבם הרגיל ושטפו כל transwell על ידי טבילה פעמיים במיליליטר אחד של מצע ללא סרום.

לאחר מכן, מקם את ה-transwell בבאר שלישית המכילה תרופות או ריאגנטים לטיפול. טפטף בעדינות באמצעות פיפטה 100 µL של מצע המכיל חומר מושך כימי (chemo attractant) אל תוך ה-transwell, מעל תערובת ה-matrigel PBS שהתגבשה. דגרי למשך שלושה עד חמישה ימים בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide כדי לדמות תאים שאינם פלואורסצנטיים הפולשים ל-Matrigel.

הניחו את ה-transwells בתוך צלחות 24 בארות חדשות והעבירו בפיפטה 1 mL של תמיסת calcium AM בריכוז 4 µM על גבי כל פלג Matrigel, ובכן אפשרו לנוזל להישפך מהצדדים כדי שיצבע מלמעלה ומלמטה. הדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחית עם 5% CO2. לאחר מכן, בצעו דימוי באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.

שיטת צביעת סגנון חיים ראשונה זו מאפשרת ויזואליזציה של דרכי פלישה. העבירו כל transwell ללוח 24 באריות חדש, כסו ב-1 mL של 4% paraform aldehyde ו-0.2% triton X 100, והדגרימו בטמפרטורת החדר למשך חצי שעה. לאחר שטיפה של שלוש פעמים עם 1 mL של PBS, הוסיפו RNAs A למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטפו פעמיים עם PBS לצורך ויזואליזציה בריכוז של 0.01 mg/mL.

דללו Propidium iodide ב-PBS והשאירו בטמפרטורת החדר בחשכה למשך 30 דקות. שטפו שלוש פעמים עם PBS. בשלב זה, ניתן לשמור את ה-transwells הצבועים ב-propidium iodide בטמפרטורת החדר בחשכה למשך חודש אחד לפחות.

שיטת סמיגת התאים השנייה דורשת קיבוע, אך מאפשרת כימות מהיר יותר של הפלישה. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי הפוך, מקמי את ה-transwell עם כמות קטנה של PBS שנותרה על כיסוי זכוכית גדול, מעל עדשה ללא טבילה בעוצמה של 20x, ובצע דגימה של חתכים אופטיים בכל 10 עד 15 מיקרון מהחלק התחתון של פלאג ה-matrigel. כמת את היקף הפלישה באמצעות החתכים האופטיים הבודדים. כמו כן, בנה אובייקטים תלת-ממדיים באמצעות תוכנה מתאימה כגון velocity מתוך סדרת החתכים האופטיים האמורה; התאים נסמגו באמצעות calcium am.

כצפוי, מספר התאים הפולשים כלפי מעלה מהמסנן פוחת ככל שהמרחק גדל. ניתן לכמת פלישה זו. שחזורים תלת-ממדיים של פלישת התאים מספקים תיאור ויזואלי של אופן הפלישה.

אם תאים סומנו על ידי ביטוי של חלבונים פלואורסצנטיים, ניתן להמחיש את המיקומים של תאים בכל צבע בשחזורים תלת-ממדיים, כפי שמוצג במבט צד זה. בנוסף, חתכים דרך השחזור יכולים לספק תובנות לגבי מנגנונים מולקולריים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובהBאופן השימוש בבדיקת פלישת תאים זו כדי להשיג מידע רב יותר על תהליך הבריחה מכזה שניתן להשיג בשיטות הסטנדרטיות.